干旱脅迫下不同抗旱水平馬鈴薯葉片蛋白質組學分析

張鳳軍， 葉景秀， 師 理， 阮建平， 王 艦

(1.青海大學農林科學院，青海西寧 810016； 2.青海省農林科學院，青海西寧 810016；3.青海大學省部共建三江源生態與高原農牧業國家重點實驗室，青海西寧 810016；4.青藏高原生物技術教育部重點實驗室，青海西寧 810016； 5.青海省馬鈴薯育種重點實驗室，青海西寧 810016)

我國是傳統農業大國，干旱是影響農業生產的重要因素之一，是造成我國農業生產不穩定的主要原因[1-2]。在我國尤其是干旱和半干旱地區，缺水問題一直是限制農業生產的最主要因子之一，即使是降水較多的地區也普遍存在季節性和非周期性干旱問題[3]。馬鈴薯是重要的糧、菜、飼兼用作物，栽培范圍遍布全球，常年播種面積穩定在2 000萬hm2左右。近年來我國馬鈴薯的種植面積得到迅速發展，種植面積達到500多萬hm2，占全球種植面積的20%以上[4]。馬鈴薯是對水分虧缺較為敏感的作物，受干旱影響較大，而我國馬鈴薯的主要種植省區都或多或少存在干旱問題[5]，干旱使這些地區馬鈴薯產量的損失超過了其總產量的30%[6]。

植物在逆境脅迫條件下，基因表達發生改變，一些正常基因被關閉，而一些與適應逆境有關的基因則被啟動，表現出正常蛋白合成受阻，而誘導合成特異蛋白即逆境蛋白[7-8]。已經發現許多逆境因子如干旱、鹽堿、低溫、高溫等，都會引起植物基因表達的變化，誘導產生逆境蛋白。植物感受這些逆境信號后通過信號轉導過程調節細胞內抗逆相關蛋白的表達，進而調整自身的生理狀態或形態的改變來適應不利環境。因此，尋找與抗逆相關蛋白(或基因)對了解植物抗逆機制以及提高植物抗逆性能有著十分重要意義。

本試驗探究不同抗旱性馬鈴薯品種(耐旱品種青薯9號[9]，干旱敏感品種費烏瑞它)在干旱脅迫下盛花期蛋白水平的響應，發掘與馬鈴薯抵御干旱脅迫相關的蛋白，為后續的抗旱基因克隆和分子育種工作提供有力支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試驗處理

試驗材料為耐旱品種青薯9號和干旱敏感品種費烏瑞它，均由青海省農林科學院生物技術研究所提供。試驗于2015年4—9月在青海省農林科學院試驗地簡易干旱棚中進行，試驗設盛花期干旱脅迫處理和全生育期正常供水對照處理。達到處理時間要求的最后1天09：00取3株頂葉下完全展開葉第4片復葉，去掉葉柄，混合放入封口袋，置于-80 ℃冰箱中保存備用[10]。

1.2 蛋白質提取

采用TCA-丙酮法[11-12]提取馬鈴薯葉片總蛋白，蛋白濃度參考Bradford法[13]測定。

1.3 雙向電泳、圖譜分析及質譜鑒定

雙向電泳操作參考葉景秀等[11]、章玉婷等[12]的方法進行(第一向IEF-PAGE，pH值為4～7的非線性IPG干膠條；第二向SDS-PAGE電泳，濃度12%的聚丙烯酰胺凝膠)進行分離，經考馬斯亮藍染色后，獲得了分辨率和重復性較好的雙向電泳圖譜。使用PDQuest 8.0.1分析軟件對雙向電泳圖譜進行分析，對找出的差異蛋白點，將差異表達的目標蛋白質點經過處理后進行串聯質譜(MALDI-TOF-MS)分析，通過Mascot、Peptldent等數據庫，對其序列進行同源性比對，鑒定耐旱的特異蛋白。

2 結果與分析

2.1 不同抗旱水平馬鈴薯盛花期葉片蛋白質組圖譜比較

青薯9號盛花期脅迫與對照相比，表達量超過對照1.5倍的蛋白質點有26個；對照表達量超過脅迫1.5倍的蛋白質點有21個，新產生蛋白1個(圖1)。費烏瑞它盛花期脅迫與對照相比，表達量超過對照1.5倍的蛋白質點有8個，新產生蛋白4個；對照表達量超過脅迫1.5倍的蛋白質點有21個，新產生蛋白1個(圖2)。

2.2 不同抗旱水平馬鈴薯盛花期葉片差異蛋白的鑒定

青薯9號共鑒定出47個差異蛋白(表1、表2)，可將它們分為5類(圖3)，分別為：(1)光合作用相關蛋白14個(占 29.79%)，其中脅迫處理鑒定出的有8個，對照處理鑒定出6個；(2)物質和能量代謝相關蛋白15個(占31.91%)，其中脅迫處理鑒定出的有9個，對照處理鑒定出6個；(3)抗氧化和防御相關蛋白8個(占17.02%)，其中脅迫處理鑒定出的有5個，對照處理鑒定出3個；(4)信號傳導和生長發育相關蛋白8個(占17.02%)，其中脅迫處理鑒定出的有3個，對照處理鑒定出5個；(5)未知功能蛋白2個(占4.26%)，其中脅迫處理的有1個，對照處理鑒定出1個。

由圖3和表1、表2可見，脅迫處理下的青薯9號在盛花期除光合作用差異蛋白質點表達數量大于對照處理外，其他幾類功能蛋白差異不大，可見由于青薯9號本身抗旱性強，脅迫和對照處理下均能建立起強大的抗旱系統，抵御外界環境的變化。

表1 脅迫下青薯9號葉片差異蛋白的質譜鑒定結果

表2 對照青薯9號葉片差異蛋白的質譜鑒定結果

費烏瑞它共鑒定出34個差異蛋白(表3、表4)，可將它們分為5類(圖4)，分別為：(1)光合作用相關蛋白7個(占 20.59%)，其中脅迫處理鑒定出的有3個，對照處理鑒定出4個；(2)物質和能量代謝相關蛋白9個(占26.47%)，其中脅迫處理鑒定出的有4個，對照處理鑒定出5個；(3)抗氧化和防御相關蛋白8個(占23.53%)，其中脅迫處理鑒定出的有4個，對照處理鑒定出4個；(4)信號傳導和生長發育9個(占26.47%)，其中脅迫處理沒有鑒定出，對照處理鑒定出9個；(5)未知功能蛋白1個(占2.94%)，其中脅迫處理的有1個，對照處理沒有鑒定出。

表3 脅迫下費烏瑞它葉片差異蛋白的質譜鑒定結果

由表3、表4和圖4可知，費烏瑞它在脅迫處理下其差異蛋白質點的表達數量少于對照處理，干旱脅迫使相關酶降解，從而使費烏瑞它抗旱性降低。

3 討論

3.1 光合作用相關蛋白

光合作用是綠色植物吸收陽光的能量，同化CO2和H2O，制造有機物質并釋放氧氣的過程，是地球上最重要的化學反應，又是一個極為復雜的，包括一系列光化學步驟和物質轉變過程，包括羧化階段、還原階段和更新階段[14]。

核酮糖-1，5-二磷酸羧化/加氧酶(ribulose-1，5-bisphosphate carboxylase/oxygenase)是植物進行光合作用羧化階段固定CO2的關鍵酶，廣泛存在于葉綠體中，肩負著光反應CO2固定和暗反應CO2釋放的雙重功能，對光合作用的效率有著非常重要的意義[15-16]；葉綠體轉酮醇酶(transketolase，TK)是植物光合作用卡爾文循環中的關鍵酶，參與光合作用中碳的固定，是植物最大光合速率的限制因子[12，17]；碳酸酐酶也與光合作用密切相關，能催化細胞質中的碳酸氫鹽轉換為CO2，增加細胞內CO2濃度，進而提高Rubisco的固碳效率[16，18]；氧不斷變化的增強蛋白2(OEE2)屬于光系統Ⅱ(PSⅡ)放氧族復合物，催化水裂解而放出氧氣，對維持光系統Ⅱ的穩定性和放氧能力起重要作用[16，19]；鐵氧還蛋白-NADP還原酶參與光系統的循環電子傳遞，催化電子從還原態的鐵氧還蛋白傳遞給NADP+，生成的還原力NADPH主要用于卡爾文循環中的CO2固定和葉綠體的其他代謝過程[20-21]；細胞色素b6-f復合體是類囊體膜上可分離的多亞基膜蛋白，它的主要功能是參與光系統Ⅰ(PSⅠ)和光系統Ⅱ(PSⅡ)之間的電子傳遞，其組成成分細胞色素b6-f復合物鐵硫亞單位是光合自養生物所必需的蛋白[22]。

表4 對照費烏瑞它葉片差異蛋白的質譜鑒定結果

本試驗中青薯9號在干旱脅迫條件下鑒定出與光合作用相關的蛋白質9個，對照組鑒定出6個，主要包括核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶、轉酮醇酶、質體醛縮酶、碳酸酐酶、鐵氧還蛋白-NADP還原酶、氧不斷變化的增強蛋白2(OEE2)、NADP-蘋果酸酶和核糖-5-磷酸異構酶等在光系統和碳同化中起重要作用的鍵蛋白。費烏瑞它在干旱脅迫條件下鑒定出與光合作用相關的蛋白質3個，對照組鑒定出4個，主要包括核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶、碳酸酐酶、NADP-蘋果酸酶和細胞色素b6-f復合體鐵硫亞基等在光系統和碳同化中起重要作用的蛋白質。青薯9號無論在脅迫條件下和對照條件下鑒定出的蛋白質均比費烏瑞它多，青薯9號在脅迫條件下鑒定出的蛋白蛋白質比對照還多，可見其應對干旱脅迫的能力較費烏瑞它強，青薯9號通過提高一些光合作用關鍵酶的表達，促進光合作用，從而提高青薯9號的抗旱性。

3.2 物質能量代謝相關蛋白

本試驗中，青薯9號在干旱脅迫條件下鑒定出與能量物質代謝相關的蛋白質7個，對照組鑒定出6個，主要包括甘油醛-3-磷酸脫氫酶、ATP合成酶β亞基、ATP合成酶CF1α亞基、ATP合成酶CF1ε鏈、烯醇化酶同工酶X1、葉綠體錳穩定蛋白、硫胺噻唑合酶、吡哆醛生物合成蛋白PDX1.3、核苷二磷酸激酶等蛋白質。費烏瑞它在干旱脅迫條件下鑒定出與能量物質代謝相關的蛋白質4個，對照組鑒定出5個，主要包括甘氨酸脫氫酶、ATP合成酶CF1ε鏈、琥珀酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、吡哆醛生物合成蛋白PDX1.3、磷酸丙糖異構酶等蛋白質。

干旱脅迫下植物體內的各種物質能量代謝平衡被打破，為了維持正常的生理活動，各種代謝過程需要調節來抵御、響應干旱脅迫。ATP合成酶廣泛存在于線粒體、葉綠體、細胞核中，是生物體能量代謝的關鍵酶，在細胞物質運輸、信號傳導、物質合成與分解等代謝活動中起決定作用[16]；青薯9號在脅迫條件下鑒定出3個與ATP合成酶相關的蛋白，為干旱條件下各類代謝活動提供動力。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDHs)在細胞的碳代謝中起著核心作用，是維持生命活動能量形成的最基本酶之一[23]。

3.3 抗氧化和防御相關蛋白質

青薯9號在干旱脅迫條件下鑒定出與抗氧化和防御相關的蛋白質5個，對照組鑒定出3個，主要包括滲調蛋白、熱休克蛋白18、L-抗壞血酸過氧化物酶、病原相關蛋白、硫氧還蛋白過氧化酶、蛋白質二硫鍵異構酶、乳腺谷胱甘肽裂合酶等蛋白質。費烏瑞它在干旱脅迫條件下鑒定出與抗氧化和防御相關的蛋白質4個，對照組鑒定出4個，主要包括滲調蛋白、70 ku熱休克蛋白、病原相關蛋白、22.7 ku熱休克蛋白、谷氧還蛋白、硫氧還蛋白、41 ku葉綠體莖-環結合蛋白等蛋白質。相關研究表明，提高植物體內抗氧化酶類代謝的水平是增強植物抗逆性的途徑之一[24]。滲調蛋白[25]、熱休克蛋白[16，26]、病程相關蛋白[16]等干旱脅迫響應蛋白在脅迫條件下的表達量增加，對提高植物的抗逆性具有重要意義。干旱脅迫下植物體內氧化還原平衡狀態會被打破，積累對植物有毒害作用的活性氧，植物可通過抗氧化酶系統等保護機制來清除活性氧，其中硫氧還蛋白[27]、L-抗壞血酸過氧化物酶[26]、谷氧還蛋白[26]等的增量表達，對植物本身穩固過氧化物酶體、清除活性氧，積極應對干旱脅迫有重要意義。

3.4 信號傳導、生長發育相關蛋白質

青薯9號在干旱脅迫條件下鑒定出與信號傳導、生長發育相關的蛋白質3個，對照組鑒定出5個，主要包括上游元件結合蛋白、Harpin結合蛋白、富含甘氨酸RNA結合蛋白、60S酸性核糖體蛋白P0、絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶PP2A-5催化亞基、NAC轉錄因子等蛋白質。費烏瑞它在干旱脅迫條件下鑒定出與信號傳導、生長發育相關的蛋白質0個，對照組鑒定出9個，主要包括33 ku核糖核蛋白、29 ku核糖核蛋白B、富含甘氨酸RNA結合蛋白、線粒體加工肽酶α亞基、延伸因子等蛋白質。

富含甘氨酸RNA結合蛋白是植物中的一種高豐度蛋白質，參與干旱等逆境的反應調節[28]；NAC轉錄因子是一種重要的調控因子，參與植物生長發育、多種防御反應以及激素信號轉導等各種生理活動，受干旱等脅迫的誘導表達，參與植物的脅迫應答[28]，在植物抗旱、高鹽等非生物逆境脅迫中起重要作用，一些NAC基因可正向或負向調控植物對干旱、高鹽脅迫的耐受能力[29]。

綜上所述，2個品種盛花期葉片中共鑒定出81個差異蛋白質，其中78個有明確生理功能。耐旱性強的品種“青薯9號”共鑒定出45個差異蛋白質，包括光合作用相關蛋白(15個)、物質能量代謝相關蛋白(14個)、抗氧化和防御相關蛋白(8個)和信號傳導、生長發育相關蛋白(8個)等；耐旱性弱的品種費烏瑞它共鑒定出33個差異蛋白質，包括光合作用相關蛋白(7個)、物質能量代謝相關蛋白(9個)、抗氧化和防御相關蛋白(8個)和信號傳導、生長發育相關蛋白(9個)等；由此可見，干旱脅迫對耐旱性弱的馬鈴薯品種影響更大，2個品種對干旱脅迫的響應調控途徑不同。植物對干旱脅迫的響應存在著非常復雜的生理生化過程，表現在多路徑和水平的調控上，本試驗只對盛花期馬鈴薯葉片在干旱脅迫下蛋白質組的響應情況作了初步研究，一些干旱脅迫相關蛋白的具體功能還不十分清楚，因此，還需要借助一些新的技術和手段對馬鈴薯的抗旱機制進行進一步研究，尋找關鍵抗逆基因，解析馬鈴薯應答干旱脅迫等逆境的分子機制。

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[1]Wu L，Liu M，Rui L. Preparation and properties of a double-coated slow-release NPK compound fertilizer with superabsorbent and water-retention.[J]. Bioresource Technology，2008，99(3)：547-554.

[2]任永峰，趙 舉，路戰遠，等. 馬鈴薯種子播前抗旱處理技術研究[J]. 北方農業學報，2013(4)：25-27.

[3]楊俊興，張 彤，吳冬秀. 磷素營養對植物抗旱性的影響[J]. 廣東微量元素科學，2003，10(12)：13-19.

[4]屈冬玉，謝開云. 加速馬鈴薯脫毒種薯三代繁育體系建設促進產業全面升級和農民脫貧致富[M]. 哈爾濱：哈爾濱工程大學出版社，2009：1-6.

[5]屈冬玉，謝開云. 加速綜合配套抗旱技術研究促進我國馬鈴薯產業健康發展[M]. 哈爾濱：哈爾濱工程大學出版社，2012：3-10.

[6]Schafleitner R. Growing more potatoes with less water[J]. Tropical Plant Biology，2009，2(3/4)：111-121.

[7]Didierjean L，Frendo P，Nasser W，et al. Heavy-metal-responsive genes in maize：identification and comparison of their expression upon various forms of abiotic stress[J]. Planta，1996，199(1)：1-8.

[8]Yun H K，Yi S Y，Yu S H，et al. Cloning of a pathogenesis-related protein-1 gene fromNicotiansglutinosaL. and its salicylic acid-independent induction by copper andβ-aminobutyric acid[J]. Journal of Plant Physiology，1999，154(3)：327-333.

[9]王 芳. 密度和基質對馬鈴薯青薯9號脫毒微型薯產量的影響[J]. 江蘇農業科學，2013，41(9)：84-85.

[10]抗艷紅，龔學臣，趙海超，等. 不同生育時期干旱脅迫對馬鈴薯生理生化指標的影響[J]. 中國農學通報，2011，27(15)：97-101.

[11]葉景秀，陳蕊紅，張改生，等. 殺雄劑SQ-1誘導小麥雄性不育花藥蛋白質組分分析[J]. 農業生物技術學報，2009，17(5)：858-864.

[12]章玉婷，周德群，蘇 源，等. 干旱脅迫條件下馬鈴薯耐旱品種寧蒗182葉片蛋白質組學分析[J]. 遺傳，2013，35(5)：666-672.

[13]Marion M，Bradford. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry，1976，72(1/2)：248-254.

[14]潘瑞熾. 植物生理學[M]. 7版. 北京：高等教育出版社，2012：69-103.

[15]魏軍亞，劉德兵，陳業淵，等. 香蕉1，5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亞基克隆與生物信息學分析[J]. 中國園藝文摘，2015(1)：16-26.

[16]陸許可，張德超，陰祖軍，等. 干旱脅迫下不同抗旱水平陸地棉的葉片蛋白質組學比較研究[J]. 西北植物學報，2013，33(12)：2401-2409.

[17]靳靜晨，馬東媛，靳永勝，等. 煙草轉酮醇酶基因(NtTK)的克隆與表達[J]. 河南農業大學學報，2008，42(5)：479-482.

[18]孫 勇，王 丹，仝 征，等. 香蕉幼苗葉片響應低溫脅迫的比較蛋白質組學研究[J]. 中國農學通報，2015，31(34)：216-228.

[19]韓平安，祿曉萍，米福貴，等. 基于蛋白質組學的高丹草苗期雜種優勢分析[J]. 作物學報，2016，42(5)：696-705.

[20]楊 超，胡紅濤，吳 平，等. 高等植物鐵氧還蛋白-NADP+氧化還原酶研究進展[J]. 植物生理學報，2014，50(9)：1353-1366.

[21]安飛飛，凡 杰，李庚虎，等. 華南8號木薯及其四倍體誘導株系葉片蛋白質組及葉綠素熒光差異分析[J]. 中國農業科學，2013，46(19)：3978-3987.

[22]梁潘霞，李楊瑞. 甘蔗細胞色素b6-f復合體鐵硫亞基(SoCYT)基因的克隆和表達分析[J]. 西南農業學報，2016，29(5)：1032-1037.

[23]盧 倩，弭曉菊，崔繼哲. 植物甘油醛-3-磷酸脫氫酶作用機制的研究進展[J]. 生物技術通報，2013(8)：1-6.

[24]夏民旋，王 維，袁 瑞，等. 超氧化物歧化酶與植物抗逆性[J]. 分子植物育種，2015，13(11)：2633-2646.

[25]徐 平，凌建群，李德葆. 一種新的與滲調蛋白基因啟動子結合的蛋白基因的分離[J]. 中國科學(C輯)，1999，29(1)：68-74.

[26]李國龍，吳海霞，孫亞卿，等. 甜菜葉片應答干旱脅迫的差異蛋白質組學分析[J]. 作物雜志，2015(5)：63-68.

[27]付晨熙，肖自華，高 飛，等. 干旱脅迫下蒙古沙冬青葉片蛋白質組學研究[J]. 生物技術通報，2017，33(6)：69-80.

[28]肖 振，趙 琪，張川芳，等. 蛋白質組學研究揭示的甘藍型油菜非生物脅迫應答機制[J]. 植物科學學報，2016，34(6)：949-961.

[29]孫利軍，李大勇，張慧娟，等. NAC轉錄因子在植物抗病和抗非生物脅迫反應中的作用[J]. 遺傳，2012，34(8)：993-1002.