干旱脅迫對白刺花根尖細胞有絲分裂的影響

吳麗芳， 魏曉梅， 尹 輝， 顏岳輝， 李 通

(1.曲靖師范學院生物資源與食品工程學院，云南曲靖 655011；2.云南省高校云貴高原動植物多樣性及生態適應性進化重點實驗室，云南曲靖 655011)

種子是有性繁殖植物的重要繁殖器官，種子能否順利萌發及萌發初期長勢直接影響到幼苗的建成、存活、競爭和個體未來的適合度。而植物種子萌發、生長發育有賴于細胞數目的增加和細胞體積的擴大，細胞數目的增加主要通過細胞分裂來實現，如果細胞分裂周期過程中遇到不利的逆境，將直接影響到植物整個生命周期活動，這一過程中，又以早期萌發生長期最具典型和敏感性。

白刺花(Sophoradavidii)屬豆科槐屬落葉灌木，在我國主要分布在云南、四川、陜西、甘肅、山西、河北、河南、湖北、湖南、江蘇、浙江等地，具深根性、抗旱強等特點，是集藥用、食用、飼料、蜜源、水土保持、改良土壤、生態修復為一體的喀斯特山地優良野生植物。云貴高原屬于典型的喀斯特地區，該區域石漠化現象日趨嚴重，且連年干旱的氣候促使生態系統岌岌可危。云南自2009—2012年出現了史無前例的旱情，且今后干旱環境將一直存在，給生態治理提出了嚴峻地考驗，從自然界中篩選抗旱植物，用于土壤、生態退化修復已收到了事半功倍的成效。干旱脅迫將導致植物一系列的連鎖反應，從對逆境的感知、傳導、轉錄因子控制到生理反應和形態結構的改變，最終影響到植物的生長發育。目前已對白刺花抗旱性進行了多方面的研究，王慧慧等研究了干旱脅迫下白刺花種子大小與種子萌發的關系[1]；邵莉研究了白刺花干旱脅迫下生理相應機制及克隆了P5CS、DREB、DHN3個與抗旱相關的基因[2]；王海珍等研究了白刺花適應干旱的生理機理[3]；王紅梅等研究了干旱脅迫下白刺花幼苗的生理生化變化[4]；吳福忠等通過施用外源氮研究了干旱河谷白刺花幼苗生長、生物量及碳、氮、磷積累與分配的關系[5]；李芳蘭等研究了干旱脅迫下白刺花的形態和生理變化[6]。從現有資料來看，多數研究主要圍繞干旱環境下白刺花種子萌發、幼苗生長過程的形態及生理生化變化以及在分子水平上相關抗旱基因的克隆，而對于從細胞分裂基礎研究干旱脅迫下的遺傳損傷少見報道?；诖?，本試驗在模擬干旱環境下，研究幼苗萌發過程中短期的干旱脅迫對白刺花根尖細胞染色體的分裂、結構變化，為進一步開展抗逆生境的基礎研究提供更多的數據資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料于2014年10月在曲靖師范學院校園里采集，脫去外殼剔除有蟲害的種子后，實驗室自然風干保存于4 ℃冰箱中備用。

1.2 萌發試驗

將健康飽滿的種子用刀片劃破種皮后，用10%次氯酸鈉消毒20 min，無菌水沖洗4～6次后放入培養皿中發芽，發芽溫度27 ℃，黑暗培養。

1.3 干旱脅迫處理

待白刺花種子萌發至根尖長1～2 cm時，于08：00分別用0%、10%、20%、30%、40%、50%聚乙二醇(PEG-6000)脅迫處理6、12、24、48 h，每處理脅迫50顆小苗，脅迫完成后，迅速用蒸餾水涮洗根尖并將根尖取下，4 ℃冰箱低溫預處理24 h，放到卡諾固定液中固定24 h，之后轉入70%乙醇于4 ℃冰箱中保存備用。

1.4 有絲分裂染色體制片

染色體制片參照李懋學的方法[7]。將準備好的材料置于0.1 mol/L HCl中，60 ℃水浴解離10～15 min直至根尖軟化，用蒸餾水漂洗3～5次后，吸水紙吸干，放在載玻片上，用刀片剔除根尖最頂端根冠后，截取少許根尖分生區，用解剖針將其搗碎并均勻地涂開，滴1～2滴卡寶品紅染液，染色2～3 min，蓋上蓋玻片，用鉛筆輕敲并用吸水紙吸干水分，酒精燈火焰上輕輕烘烤，以利于細胞分散。

1.5 鏡檢及觀察統計

將制備好的裝片置于顯微鏡的載物臺上，先在低倍鏡(10×10)下找到分生組織區細胞分散均勻、分裂相較多的區域，再到高倍鏡(10×40)下觀察。每處理的根尖至少觀察10個裝片，每個裝片在高倍鏡下觀察和統計10個視野，記錄每個視野中觀察的總細胞數、分裂細胞數及各分裂相的比率。

1.6 干旱脅迫后觀察根尖細胞有絲分裂、微核、染色體畸變指標

測定計算的指標參照周錦雯的方法[8]。有絲分裂指數=處于分裂期的細胞數/總細胞數×100%；有絲分裂指數下降速度=-(有絲分裂指數T-有絲分裂指數t)/有絲分裂指數t×100%；染色體畸變率=染色體畸變細胞數/分裂細胞數×100%。其中，有絲分裂指數T表示處理時的有絲分裂指數；有絲分裂指數t表示同一時間處理下對照組的有絲分裂指數。微核率(micronucleus frequency，簡稱MNF)是指1 000個細胞中微核細胞數所占的比例。

1.7 數據分析

試驗數據用Excel和DYES軟件進行處理，單因素隨機區組試驗進行方差分析，LSR法檢驗各處理間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫對白刺花根尖細胞有絲分裂的影響

由表1可知，隨著PEG-6000濃度的增加和處理時間的延長，白刺花根尖細胞有絲分裂表現出不同的差異。低濃度PEG-6000≤10%時，在處理6～12 h內，同一時間處理下與對照差異不顯著；0～6 h短期處理下，對白刺花根尖細胞有絲分裂有一定的促進作用，有絲分裂指數從8.78%上升至 9.09%。隨著脅迫濃度的增加，其濃度>10%后，有絲分裂細胞減少，表現出了一定的抑制效應。尤其當濃度達到50%時，脅迫6 h時的細胞分裂指數為3.14%，而當脅迫48 h后，有絲分裂指數僅1.96%，可以非常明顯地觀察到幾乎所有細胞都已停止了分裂。結果表明，PEG-6000干旱脅迫對白刺花根尖細胞有絲分裂的影響不僅與處理時間有關，而且與處理濃度也有密切關系，是二者共同作用的結果。

注：同列數據后不同小寫字母、大寫字母分別表示在0.05、0.01水平上差異顯著、極顯著。表3、表4同。

植物根尖細胞分裂指數的大小反映了植物生長發育的狀況，同時也反映出細胞分裂活性的高低。從表2中可以看出，隨著處理時間的延長和處理濃度的增加，有絲分裂指數下降速率明顯在上升。當處理時間為6 h、處理濃度10%時，有絲分裂指數下降速率為-3.53%；當濃度增加至50%，有絲分裂指數下降速率為64.24%；當處理時間為48 h、濃度為50%時，有絲分裂指數下降速率最大，為78.32%。從整個變化趨勢來看，細胞有絲分裂能力隨處理時間的延長和濃度的升高不斷降低。

2.2 干旱脅迫對白刺花染色體畸變的影響

由表3可知，染色體畸變率高低與處理濃度和處理時間呈正相關。當處理時間為12 h、PEG-6000濃度≤10%時，與對照處理差異顯著；當處理時間超過12 h，各濃度處理與對照差異極顯著。當處理濃度>30%時，白刺花根尖細胞染色體畸變率均超過10%，尤其當濃度為50%、處理48 h時染色體畸變率高達16.05%。結果表明，染色體畸變率與處理時間、處理濃度均有關系。

表2 干旱脅迫對白刺花根尖細胞有絲分裂指數下降速率的影響

染色體畸變率往往通過多種類型而表現，在本試驗中，可以觀察到染色體斷片、落后染色體、染色體橋、多極分裂、染色體濃縮等(圖1至圖7)。通過研究觀察，染色體斷片是最常見的畸變類型，染色體斷片通常是由于在理化因素的作用下1個染色體發生1處或多處斷裂而不重接且無著絲粒的節段，如果染色體丟失片段比較大，或丟失片段上載有控制性狀的主基因，將會不可逆地導致細胞或生物體死亡。染色體橋是染色體發生斷裂，帶有著絲粒的2條染色體再經重接，當2個染色單體后期向兩極分開，二者兩臂仍粘連在一起所形成的。落后染色體的產生有2種，一種是細胞有絲分裂前中期，染色體不規則排列在赤道板上時，有個別染色體或染色體片斷未能按時到達赤道板的位置；另一種是細胞有絲分裂后期，正常細胞的染色體都移向兩極，而個別染色體或染色體片斷滯留于兩極之間，與染色體的主體部分移向兩極的速度和進程不同而形成的。落后染色體經細胞分裂，可能隨機趨向于細胞分裂的一極，也可能隨細胞的分裂而丟失。

表3 干旱脅迫對白刺花根尖細胞染色體畸變率的影響

2.3 干旱脅迫對白刺花根尖細胞微核的影響

微核也是染色體畸變的一種形式，早期微核技術主要用于水質的檢測方面。微核位于細胞質中，直徑是主核的1/20至1/3，是完全與主核分開的圓形或橢圓形的小核。從表4可以看出，當PEG-6000濃度小于20%時，微核率在10‰以下；當PEG-6000濃度高于20%后，微核率均大于10‰，尤其當濃度達到50%時，處理48 h的微核率最高，達15.76‰。早期研究認為，微核僅出現在細胞分裂的間期，后來經過多年研究發現，細胞分裂的任何時期都能產生微核，且微核的大小與處理時間、處理濃度有關。本試驗中也觀察到不同分裂時期的微核(圖8至圖11)。

表4 干旱脅迫對白刺花根尖細胞微核的影響

3 討論

PEG-6000作為一種滲透調節劑，它能模擬干旱逆境的原因是其可阻塞植物的輸導組織。Kaufmann等研究得出，PEG-6000誘導水分逆境所取得的效果與土壤干旱是一樣的，PEG-6000誘導下引起植物內源激素如ABA積累，而植物根部對ABA的反應最為敏感，從而導致植物生長受到抑制[9]。再者干旱脅迫下植物由于脫水使膜的構成或結構發生改變，導致質膜透性增加，細胞膜系統遭受破壞。在對小麥[10-11]、柑橘[12]、番茄[13]等研究中發現干旱脅迫下植物細胞破裂、內溶物溢出，多數葉綠體溶解散亂在基質中，細胞保護酶系統發生顯著變化。在抑制植物生長方面，干旱脅迫可能降低與DNA合成有關的酶活性，致使DNA的合成速率減慢，細胞分裂的間期延長[14]。本研究也觀察到，白刺花根尖細胞有絲分裂指數隨著PEG-6000處理濃度升高和處理時間延長明顯下降。短期(6 h)低濃度(PEG-6000濃度10%)有一個上升趨勢，這可能是植物短期內適應環境變化的應激反應，使相當一定時期內代謝增強，細胞周期加快導致，而當植物自身應激反應超過防御保護屏障后，植物的生長發育就會受到影響，甚至死亡，從而導致細胞分裂能力降低。

染色體畸變是植物細胞有絲分裂過程中受到理化因素的影響，DNA或蛋白質的合成受到干擾，諸如紡錘體蛋白等與染色體運動有關的生物分子不能合成或合成量不足，或染色體損傷后不能及時正常修復而導致[15]，有染色體橋、染色體斷片、細胞多極化等畸變類型。本研究中，PEG-6000濃度 0～20%、處理24 h內時，白刺花根尖細胞染色體畸變率在10%以下，當濃度大于30%時，染色體畸變率均在10%以上。本試驗中，觀察到了染色體斷片、染色體橋、染色體多極化、染色體濃縮等多種類型的畸變，其中染色體斷片是主要的畸變類型。染色體濃縮可能是長時干旱脅迫致使細胞合成代謝受阻，抑制微管蛋白的組裝，抑制調控細胞分裂的各種酶類的活性，使染色體被原位抑制而縮短變粗導致的。如在某些熱擊研究中，細胞在熱激處理下合成熱激蛋白，而熱激也可能導致染色體的快速濃縮。

微核是染色體畸變的一種形式之一，可能是染色體發生斷裂或部分落后染色體在細胞分裂的后期行動滯后，不能進入子細胞的主核而成[16-17]。微核多出現于細胞分裂的間期，但在細胞分裂的前期、中期、后期均能看到，而末期微核數微乎其微。

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[1]王慧慧，王普昶，趙 鋼，等. 干旱脅迫下白刺花種子大小與萌發對策[J]. 生態學報，2016，36(2)：335-341.

[2]邵 莉. 白刺花干旱和鹽脅迫下生理相應機制及抗旱相關基因克隆[D]. 武漢：華中農業大學，2012.

[3]王海珍，梁宗鎖，郝文芳，等. 白刺花(Sophoraviciifolia)適應土壤干旱的生理學機制[J]. 干旱地區農業研究，2005，23(1)：106-110.

[4]王紅梅，包維楷，李芳蘭. 不同干旱脅迫強度下白刺花幼苗葉片的生理生化反應[J]. 應用與環境生物學報，2008，14(6)：757-762.

[5]吳福忠，包維楷，吳 寧. 外源施 N對干旱河谷白刺花(Sophoradavidii)幼苗生長、生物量及C、N、P積累與分配的影響[J]. 生態學報，2008，28(8)：3817-3825.

[6]李芳蘭，包維楷，吳 寧. 白刺花幼苗對不同強度干旱脅迫的形態與生理響應[J]. 生態學報，2009，29(10)：5406-5416.

[7]李懋學. 作物染色體及其研究技術[M]. 北京：中國農業出版社，1996.

[8]周錦雯. 鎘對蠶豆根尖細胞有絲分裂的影響[D]. 成都：四川師范大學，2006.

[9]Kaufmann M R，Eckard A N. Evaluation of water stress control with polyethylene glycols by analysis of guttation[J]. Plant Physiology，1971，47(4)：453-456.

[10]武玉葉，李德全. 土壤水分脅迫對冬小麥葉片滲透調節及葉綠體超微結構的影響[J]. 華北農學報，2001，16(2)：87-93.

[11]張永平，王志敏，吳永成，等. 不同供水條件下小麥不同綠色器官的氣孔特性研究[J]. 作物學報，2006，32(1)：70-75.

[12]謝深喜，張秋明，熊興耀，等. 水分脅迫對柑橘葉片和根系細胞超微結構的影響[J]. 湖南農業大學學報(自然科學版)，2008，34(2)：168-172.

[13]齊紅巖，劉 洋，劉海濤. 水分虧缺對番茄葉片氣孔特性及葉綠體超微結構的影響[J]. 西北植物學報，2009，29(1)：9-15.

[14]段昌群，王煥校. 重金屬對蠶豆的細胞遺傳學毒理作用和對蠶豆根尖微核技術的探討[J]. 植物學報，1995，37(1)：14-24.

[15]Qian X W. Mutagenic effects of Chromium trioxide on root tip cells ofViciafaba[J]. Journal of Zhejiang University Science，2004，5(12)：1570-1576.

[16]曹 佳. 微核試驗在中國的應用、發展與展望[J]. 遺傳，2003，25(1)：73-76.

[17]陳宏偉. 微核及微核試驗的應用與發展[J]. 齊齊哈爾醫學院學報，2004，25(10)：1160-1164.