浮萍分布與水環境因子的相關性研究

陳 蕾， 成家楊， 謝 靖， 唐 杰

(北京大學深圳研究生院，廣東深圳 518055)

浮萍(Lemnaminor)是最小的和最簡單的水生植物之一，廣泛分布于世界各地，多生長于湖泊、河流灣汊、沼澤、農田等靜水之中。經過幾十年的調查研究，目前已知的浮萍共分為5屬38種，分別為青萍屬(Lemna)、多根紫萍屬(Spirodela)、少根紫萍屬(Landoltia)、蕪萍屬(Wolffia)和無根蕪萍屬(Wolffiella)[1]。而中國的浮萍則以青萍、多根紫萍、少根紫萍和蕪萍為主，共4屬12種[2]。浮萍因其繁殖速度快、淀粉含量高、生物質產量大等優點，而成為極具潛力的新一代生物能源原料。Landolt等的研究結果表明，在適宜的生長條件下，浮萍的淀粉含量最高可達75%[3]；而Xu等的研究發現，浮萍的生物質干質量產量可達39.1～105.9 t/hm2，遠高于玉米、柳枝稷、芒草等能源植物[4]。

浮萍除了作為生物能源的原料外，在污水處理領域也有廣泛的應用，這主要歸因于浮萍對各種水環境的較強適應力，以及其去除污水中的氮、磷和重金屬的能力。如Xu等研究發現，紫萍能夠很好地去除豬場稀釋廢水中的氨氮和磷酸磷，去除率分別為1.08、0.10 g/(m2·d)[5]；Miretzky等模擬自然環境的水污染，研究浮萍對重金屬Fe、Zn、Mn、Cu、Cr和Pb的去除效果，結果表明，浮萍對這6種重金屬的去除率分別可達78.47%、97.56%、95.20%、90.41%、96.64%和98.55%[6]；Dirilgen研究了不同Cr濃度條件下，青萍對Cr吸附效果的差異，結果表明，在pH值為5.0的條件下，當Cr處理濃度取 10 mg/L 時，青萍單位鮮質量去除量達最高，可達(863±38.8) mg/kg[7]。

浮萍雖具有潛在的污水處理能力，但不同種屬浮萍甚至不同來源的同種浮萍在污染水體中的生長狀況以及污水凈化效果存在明顯差異[8-13]。例如，Kanoun-Boule等研究發現，青萍對Cu的富集效果優于紫萍[10]；Chaudhuri等研究了不同濃度下青萍和紫萍對水體中Cd的去除能力，去除率分別為42%～78%和52%～75%[14]；紫萍對Cd的去除效果優于青萍，單位鮮質量去除量最高可達7 711.00 mg/kg；周雄飛研究發現，不同種屬浮萍對總氮、總磷的去除效果不同，當青萍和紫萍以 1 ∶2 的比例混合培養時，對總氮、總磷的去除效果最好[15]。由此可見，浮萍對污水的耐受能力及處理效果與浮萍種屬以及污水類型有直接關系。而自然界中的浮萍種屬分布是否與其生活的水環境因子相關仍然不清楚，而相關研究結果對未來利用浮萍修復自然水體具有一定的指導意義。

本研究以江蘇、廣東2省的浮萍材料及其生活水環境為研究對象，調查區域性的浮萍分布及其生長水環境，并研究浮萍分布與水環境因子的相關性。本研究選擇江蘇、廣東2地進行取樣主要基于以下2個原因：(1)江蘇、廣東分別位于長三角、珠三角地區，都是工農業發達的省份，淡水資源污染呈上升趨勢[16-17]。而對該地區浮萍的分布及其生長的水環境調查開展較少，限制了該地區浮萍資源的開發以及在水體凈化方面中的應用。(2)兩省地理位置相隔較遠。較單一地區樣品以及多地區樣品更具有一般性，有助于保證相關性研究的準確性。

1 材料與方法

1.1 浮萍和水樣采集

2015年4月，在江蘇、廣東2省隨機選擇了59個采樣點進行樣品采集，樣品采集地的GPS信息和浮萍分布如表1所示。

表1 樣品采集地浮萍分布及采集地經緯度

注：La、Lp、Sp、Wg分別代表青萍、多根紫萍、少根紫萍和蕪萍；La+Sp代表青萍和多根紫萍共生；Sp+Wg代表多根紫萍和蕪萍共生。

浮萍樣品采集后，立即裝入7.5 cm×10 cm的無菌密封袋中，并放置在簡易冰盒中保存。同時，取40～50 mL的表層水樣于50 mL離心管中，立即放入冰盒中保存。樣品帶回實驗室后立即進行預處理。水樣放入-20 ℃冰箱保存，而浮萍則按以下方法進行處理：首先用蒸餾水清洗浮萍，去除雜質；然后用0.5% NaClO溶液對浮萍葉片消毒1 min，再用去離子水漂洗2～3次，放入SH改良培養液中培養。SH改良培養液成分：硝酸鉀2.50 g/L，硫酸鎂0.20 g/L，磷酸二氫銨 0.30 g/L，無水氯化鈣0.15 g/L，乙二胺四乙酸二鈉 19.80 mg/L，六水氯化鈷0.10 mg/L，無水硫酸銅0.20 mg/L，硼酸5.00 mg/L，碘化鉀1.00 mg/L，一水硫酸錳10.00 mg/L，二水鉬酸鈉0.10 mg/L，七水硫酸鋅1.00 mg/L。設置光照培養箱的溫度為25 ℃，光照度為7 000 lx，光—暗周期為16 h—8 h，使其盡快適應實驗室環境，快速增殖擴大生物量，用于浮萍分子鑒定。

1.2 浮萍種屬鑒定

采用DNA Barcoding鑒定浮萍種屬。使用植物基因組DNA提取試劑盒(深圳新拓撲生物科技有限公司)提取浮萍的總DNA，并合成用于擴增atpF-atpH間隔序列的引物(Forward：5′-ACTCGCACACACTCCCTTTCC-3′；Reverse：5′-GCTTTTATGGAAGCTTTAACAAT-3′)[18]。以浮萍總DNA為模板，采用PCR擴增atpF-atpH間隔序列。PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性45 s，49 ℃退火 1 min，72 ℃延伸40 s，共進行35循環；最后72 ℃延伸 10 min。PCR產物經純化后送到華大基因(BGI)進行測序。采用Lasergene.v7.1軟件對測序結果進行分析和拼接，將組裝序列在NCBI網站上(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行Blast比對。根據Blast比對結果，選取參考浮萍序列。在MEGA 6.0軟件中采用Neighbor-joining法繪制系統發育樹，分析本研究收集浮萍與參考浮萍間的親緣關系。

1.3 水樣分析

1.3.1 水體pH值、氨氮、硝氮、總磷含量的測定 水樣在測定之前，先用0.45 μm的濾膜過濾除雜，而后分別測定水體pH值(雷磁PHS-25)、氨氮含量(納氏試劑分光光度法HJ535-2009)、硝氮含量(紫外雙波長分光光度法)、總磷含量(過硫酸鉀氧化-鉬酸銨分光光度法GB 11893—1989)。

1.3.2 水體重金屬濃度的測定 水樣過0.22 μm的濾膜后，稀釋10倍，采用Thermo Fisher X SERIESⅡ測量樣品中重金屬的濃度。首先，配制成0、20、25、50、100 μg/L系列標準溶液。以比率與濃度進行線性回歸，繪制標準曲線。Cr、Mn、Ni、Cu、Zn、Cd、Pb這7種元素的標準曲線線性相關性較好，相關系數均大于0.999 0。然后，根據標準曲線的結果，計算水體中Cr、Mn、Ni、Cu、Zn、Cd、Pb這7種重金屬的濃度。

1.4 浮萍種質資源分布與水環境影響因子相關性分析

采用CANOCO 4.53軟件對實驗數據進行除趨勢對應分析(DCA)和RDA分析。首先進行DCA分析。DCA是一種間接排序方法，能夠將分析對象在二維和三維空間加以梯度排列，一般來說，梯度長度小于3，選擇線性模型比較合理，介于3～4之間，單峰模型和線性模型都是合適的，梯度大于4，選擇單峰模型比較合理。對實驗數據進行DCA分析后，梯度長度為1.456 4(<3)，因此使用線性模型RDA分析浮萍種屬與環境因子之間的相關關系。在RDA排序圖內，環境因子一般用箭頭表示，箭頭連線的長度代表某個環境因子與種屬分布間相關程度的大小，連線越長，說明相關性越大。為消除量綱的影響，分析前用Excel 2010軟件對數據進行lg(x+1)處理。

1.5 數據統計與分析

所有試驗均設3個平行。利用Excel 2010和SPSS 19.0軟件對試驗數據進行統計分析。

2 結果與討論

2.1 浮萍種屬鑒定

本研究總共獲得了59份浮萍樣品，其中4個樣品存在2種浮萍共生現象(表1)，故共獲得63株浮萍。經系統發育學鑒定(圖1)，63株浮萍分別屬于青萍(51株)、多根紫萍(9株)、少根紫萍(2株)和蕪萍(1株)。結合表1可以看出，2個省的樣品采集地浮萍分布均以青萍為主，其次是多根紫萍和少根紫萍。該結果與Tang等的研究[19]一致，表明在中國青萍的分布占主導優勢，這可能跟其適應性相關。而本研究中鑒定的浮萍，除了JS10、JS20與參考浮萍L.aequinoctialis6612的相似度為97.7%和99.7%外，其余61株浮萍與其對應參考浮萍的相似度均為100%。結果表明這些浮萍的atpF-atpH基因序列相對保守，適合用于系統發育分析，能準確鑒定出浮萍的種屬。

2.2 浮萍生長環境

分別從平均值、標準差、范圍、中位數和變異系數對水樣結果進行分析，評價浮萍生長水體的水質狀況。因樣品中少根紫萍和蕪萍的數量較少，因此只列出了測定結果，而沒有進行其他統計學分析。

2.2.1 浮萍生長水體的水質狀況(pH值、氨氮、硝氮、總磷) 從表2中浮萍生長的pH值范圍和中位數可以看出，青萍、多根紫萍均適宜在偏堿性的水體中生長，而少根紫萍和蕪萍也采自堿性水體。青萍在6.70～9.50的酸堿環境中均有分布，相對于多根紫萍能夠適應更廣范圍的pH值。張飛等對太湖流域的水體調查結果表明，青萍在pH值6.34～8.78的范圍均有分布[20]，該研究中青萍具有更廣的酸適應性，而本研究中的青萍具有更廣的堿適應性。這些研究結果表明，青萍對水體pH值的耐受范圍優于其他種屬。因此，青萍可優先考慮用作治理pH值變化較大的水體。

根據我國GB 3838—2002《地表水環境質量標準》相關規定，V類水的氨氮濃度≤2.0 mg/L，總磷濃度≤0.4 mg/L。而本次采集的59份水樣中，有25份水樣的氨氮濃度、38份水樣的總磷濃度超過了V類水標準。總體來看，本次采樣地區的水體存在一定的氮、磷污染，部分水體污染較為嚴重。

本研究中青萍生長水體的氨氮濃度平均值遠遠高于其他3個種屬，且青萍在氨氮濃度0～5.02 mg/L的范圍均有分布，說明青萍對氨氮的耐受能力強，且適宜在氨氮濃度較高的水體中生長。因此，后續可進一步研究、篩選青萍品種治理氨氮污染水體。通過對比青萍和多根紫萍的水體環境發現，青萍生長水體的硝氮濃度范圍是多根紫萍的2.5倍，平均值略低于多根紫萍。而張飛等的研究中，青萍與多根紫萍在水體硝氮濃度方面的差異并不顯著[20]。這表明，不同來源的同種浮萍對硝氮的耐受能力存在差異，因此對地理小種生理特性的鑒定是非常必要的。此外，本研究中青萍所生長水體總磷的平均值為1.35 mg/L，為多根紫萍的1.5倍，且總磷濃度最高的采樣點亦為青萍生長的水體，說明青萍對總磷的耐受能力更高，在0.04～9.05 mg/L范圍均有分布。

表2 浮萍生長水體的pH值、氨氮、硝氮、總磷的含量

綜上所述，青萍對pH值、氨氮、硝氮、總磷的耐受能力均強于多根紫萍，對水體各指標廣泛的耐受能力可能是青萍廣泛分布的主要原因。

2.2.2 浮萍生長水體的水質狀況(重金屬) GB 3828—2002《地表水環境質量標準》中規定Ⅱ類水體中Cr(六價)的濃度≤50 μg/L，Mn的濃度≤4 000 μg/L，Cu的濃度 ≤1 000 μg/L，Zn的濃度≤1 000 μg/L。從Cr、Mn、Cu、Zn這4個重金屬濃度的指標來看，本次采集的水體樣品均未超地表水Ⅱ類水水質標準(表3)。根據標準中對Ⅰ類水的規定，本次采集的59份水樣均滿足Ⅰ類水對Cd、Pb濃度的要求。總體來看，本次采集的水樣受重金屬污染程度較小。

對比表3中浮萍生長水體中的重金屬含量發現，青萍生長水體的Mn濃度平均值為458.92 μg/L，Ni濃度平均值為11.92 μg/L，Cu濃度平均值為1.70 μg/L，Zn濃度平均值為30.19 μg/L，分別為多根紫萍的4.8倍、7.4倍、3.6倍、5.8倍，也高于少根紫萍和蕪萍。這些結果表明，本研究中的青萍與其他浮萍品種相比，對Mn、Ni、Cu、Zn具有更廣的重金屬耐受范圍。多根紫萍生長水體的Cr濃度平均值為10.00 μg/L，高于青萍的6.12 μg/L，亦高于少根紫萍和蕪萍。多根紫萍生活水體的Cr濃度范圍為5.37～28.93 μg/L，而青萍的僅為0.20～13.96 μg/L。雖然多根紫萍對Mn、Ni、Cu、Zn的耐受能力不如青萍，但是多根紫萍對Cr的耐受能力明顯強于青萍，故在處理Cr含量較高的污染水體時，應優先考慮選用多根紫萍。因水樣的Cd、Pb濃度均很低，故較難判斷4個種屬對Cd、Pb耐受能力的高低。

表3 浮萍生長水體的重金屬濃度

浮萍對重金屬的耐受能力因種屬不同而存在差異。因此，廣泛收集各地浮萍樣本并篩選優質的浮萍品種，對有針對性地處理不同重金屬污染的水體至關重要[21-22]。而自然界中的浮萍分布是否與水體重金屬濃度有關，需要進一步的研究。

2.4 浮萍分布與環境因子相關性分析

本次采集的63株浮萍中，少根紫萍和蕪萍僅有3株，分析其與環境因子的相關性不具代表性，故只對青萍和多根紫萍進行浮萍分布與環境因子的相關性分析。

2.4.1 利用Spearman分析環境因子自相關性 在進行浮萍與環境因子的相關性分析之前，首先對環境因子的自相關性進行分析。Spearman相關性分析能夠評估環境因子兩兩之間的相關性，S-W檢驗結果顯示，峰度系數和偏度系數均不為0，表明環境因子數據不符合正態分布，故采用Spearman進行相關性分析更為合理，分析結果如圖2所示。從圖2可以看出，Cd、Ni、Pb、Zn、Cu 5個環境因子彼此之間顯著相關(P<0.01)。為減少數據分析的重復性，從Cd、Ni、Pb、Zn、Cu中選擇任意一種做后續分析即可，pH值、硝氮、氨氮、總磷、Cr、Mn皆可作為自由的環境因子。

2.4.2 利用RDA分析浮萍分布與環境因子的相關性 選擇Cu作為Cd、Ni、Pb、Zn、Cu 5種環境因子的代表，pH值、硝氮、氨氮、總磷、Cr、Mn作為自由的環境因子，分析這7種環境因子與青萍、紫萍2個浮萍品種的相關性，RDA結果如圖3所示。

RDA相關性分析結果顯示，環境因子對青萍和多根紫萍分布的影響從高到低依次為氨氮、pH值、Cr、總磷、硝氮、Mn、Cu。RDA的總解釋量為27.57%，第一坐標軸、第二坐標軸軸線分別解釋了26.45%、1.12%的浮萍分布與環境因子的相關性。經過對所有約束特征值999次1%的置換迭代計算(表4)，得出浮萍分布與環境因子的相關顯著性P值，結果表明，pH值、氨氮的P值均小于0.05，表明這2個環境因子與青萍和多根紫萍的分布具有顯著相關性，其中氨氮對浮萍的分布具有極顯著影響(P<0.01)。

表4 浮萍分布與環境因子相關顯著性檢驗

注：“**”表示極顯著相關(P<0.001)；“*”表示顯著相關(P<0.01)。

RDA分析結果顯示氨氮對浮萍分布的影響最大，表明浮萍生長對氨氮濃度很敏感。一方面，氨氮能夠提供浮萍生長所需要的營養元素N，另一方面，氨氮濃度過高會抑制浮萍的生長。Ingermarsson等的研究結果也表明，浮萍的細胞膜能夠對NH4+做出響應[23]，具體機制目前還尚未清楚。Warren研究發現，當水體中氨氮濃度過高時，電離出的NH3會擾亂浮萍代謝[24]。本次調查過程中發現，江蘇水樣氨氮的平均值為0.810 mg/L，遠低于廣東地區的平均值2.710 mg/L。廣東地區水體的氨氮濃度過高，因此耐受能力較差的多根紫萍、少根紫萍、蕪萍難以存活，只有青萍可以適應生長。這或許是江蘇地區浮萍多樣性更豐富的原因之一。RDA的分析結果還表明，pH值對浮萍分布具有顯著影響。許多研究也表明，pH值對浮萍的生長、發育以及重金屬的修復等方面具有顯著影響[25]。本次調查，廣東地區和江蘇地區水體pH值平均值分別為7.801和7.753，pH值范圍分別為7.160～9.500和 6.700～9.220。江蘇地區水體pH值稍低于廣東地區，這或許也是江蘇地區浮萍覆蓋廣、品種多的另一個原因。

3 結論

從江蘇、廣東2地采集的浮萍經鑒定為青萍、多根紫萍、少根紫萍和蕪萍。其中青萍占所采集樣品數的81%，為優勢浮萍品種；水質分析表明，采樣地區的水體存在一定的氮、磷污染，部分水體較為嚴重。青萍、多根紫萍均適宜在偏堿性的水體中生長。而青萍能夠適應更廣范圍的pH值，對氨氮、硝氮、總磷的耐受能力也比其他浮萍強，是青萍廣泛分布的原因之一；所采集59份水樣的重金屬濃度均未超地表水Ⅱ類水質標準，受重金屬污染程度較小。青萍與其他浮萍品種相比，對Mn、Ni、Cu、Zn具有更廣的耐受范圍，而多根紫萍對Cr的耐受能力較好；氨氮、pH值與浮萍分布具有顯著相關性，是導致2個地區浮萍差異分布的主要因素。

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