施用微生物菌肥“寧盾”對辣椒根圍細菌多樣性及土壤酶活性的影響

楊 威， 閆海霞， 張貝貝， 張溫馨， 郭堅華， 羅玉明

(1.淮陰師范學院生命科學學院/江蘇省環洪澤湖生態農業生物技術重點實驗室，江蘇淮安 223300；2.江蘇省淮安市農業技術推廣中心，江蘇淮安 223300； 3.南京農業大學植物保護學院，江蘇南京 210095)

淮安紅椒產自我國地理南北分界線特定的江蘇省淮安市轄區內，已有近30年的發展歷史，先后榮獲“國家地理標志證明商標”“江蘇省名牌農產品”等殊榮。近年來，淮安紅椒生產呈現出快速發展的態勢，截至2010年，淮安市大棚紅椒種植面積達1.4萬hm2，占全市設施蔬菜面積的36.2%。全市年產紅椒45萬t以上，年銷售收入超過23億元[1-2]。在快速發展的同時，淮安紅椒在種植過程中也存在一系列問題。如規模經營比例較小、無公害標準化生產技術難以推廣以及濫用農藥現象較多，產品質量存在安全隱患。其中，特別是在病蟲害的防治過程中，化學農藥的大量使用，對食品安全，品牌效應的提升等產生了嚴重的阻礙。其中，在淮安紅椒的生產過程中，尤以疫病的發生最為嚴重。辣椒疫病是由辣椒疫霉(PhytophthoracapsiciLeon)引起的一種毀滅性病害，一般田間發病率為5%～65%，平均發病率達24.4%，發病嚴重的可減產40%～70%，甚至絕收[3]。對辣椒疫病的防治方法主要包括種植抗病品種、農業防治、化學防治、生物防治。抗病品種使用較少，最常使用的防治方法是化學防治，主要藥劑包括甲霜靈、代森錳鋅、甲霜·錳鋅、氧化亞銅可濕性粉劑等(http：//www.chinapesticide.gov.cn)。

對于辣椒疫病的生物防治在國內外均有較多的研究。Segarra等比較了生防制劑棘孢木霉T34和土菌靈在辣椒疫病防治中的效果，發現T34菌株的防治效果達71%，而土菌靈只有在與病原菌同時接種時才能起到防治作用[4]。Sopheareth等在2013年報道，伯克霍爾德式菌(Burkholderiacepacia)MPC-7制劑能夠顯著防治辣椒疫病，平均防效達60%，同時該生防菌能夠顯著促進植物的生長及生物量的增加[5]。劉永亮等通過平板對峙法篩選得到1株金色毛殼菌HTC，對辣椒疫病的防治效果高于70%[6]。歐雄常等應用紅樹內生細菌解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)RS261菌株在辣椒植株根部定殖防治辣椒疫病，6 d時的防治效果高于80%，并增強了植株的防御酶活性[7-8]。人們還發現，生防菌能夠產生生物膜來阻擋辣椒疫霉的侵染。如約氏黃桿菌GSE09能夠在植物體表面產生生物膜，同時產生一些吲哚類化合物、酵母促生物、表面活性劑等物質來防治辣椒疫霉[9]。這些生防菌生物膜和代謝產物在辣椒根圍形成了一定的屏障，改變了根圍微生態環境，但根圍微生態改變的意義尚未引起足夠的重視。

微生物菌肥“寧盾”是由筆者所在項目組前期與南京農業大學聯合開發研制，于2013年取得生物肥料正式登記證[微生物肥(2013)準字(1096)號]。在前期工作中，“寧盾”在防治辣椒土傳病害中取得了較好的效果[10-11]，在研究中發現“寧盾”的使用對田間病害的防治效果可以持續到下一茬作物，下一茬種植過程中即便不再施藥，辣椒仍然生長良好，病害發生較輕。因此，本試驗旨在檢測“寧盾”在防治辣椒土傳病害過程中，對辣椒根圍細菌多樣性及主要土壤酶活性和土壤養分的影響，以期為該微生物菌肥的進一步應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計及土壤樣品采集

本研究地點設在江蘇省淮安市農業技術推廣中心蔬菜園區，在辣椒移栽時利用微生物菌劑“寧盾”進行灌根處理，并分別在移栽1、2、3個月后采集辣椒根圍土壤進行檢測。以未使用微生物菌劑的辣椒作為對照組，處理組和對照組試驗小區隨機分布，每個處理3次重復，每個小區面積為3 m×2 m。處理組包含4個辣椒品種，分別為紅優4號(TH)、馬六(TM)、好農50(TA)、蘇椒5號(TS)，對照組為紅優4號(CH)。

整個土壤采集過程采用3點取樣法，每個小區選取3株間距1 m的辣椒植株，首先將植株拔出，輕輕抖動以去除黏附在根部的大量土壤，再利用毛刷輕輕刷下緊貼在辣椒根部的土壤，3株辣椒土壤樣品混合在一起，裝入塑封袋放在冰盒中帶回實驗室。樣品前期處理后研磨過2 mm篩，一部分進行土壤總DNA的提取、變性梯度凝膠電泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，簡稱PCR-DGGE)分析；另一部分置于陰涼通風處自然干燥至恒質量，用作土壤理化性質及酶活性檢測；剩余的則置于 -20 ℃ 冰箱保存備用。

1.2 土壤樣品DNA提取及DGGE分析

本研究利用FastDNA SPIN Kit for Soil試劑盒(MP Bio，USA)進行土壤樣品總DNA的提取，提取方法參照試劑盒試驗說明。以樣品基因組DNA為模板，采用細菌通用引物 GC-338F 和518R擴增樣品16S rDNA高變區序列，引物信息如表1 所示。

表1 土壤樣品16S rDNA擴增引物信息

PCR擴增體系(50 μL)：10× PCR buffer 5 μL、dNTP(2.5 mmol/L)3.2 μL、rTaq(5 U/μL)0.4 μL、GC-338F(20 μmol/L)1 μL、518R(20 μmol/L)1 μL、模板DNA 50 ng、補充ddH2O至50 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性 1 min，55 ℃復性45 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；最終 72 ℃ 延伸10 min。PCR產物采用OMEGA公司DNA Gel Extraction Kit試劑盒純化回收。DGGE梯度膠根據Heuer等的方法[12]制備。DGGE在DCode突變檢測系統(Bio-Rad)中完成。用25 μL PCR濃縮產物進行DGGE，采用變性梯度為30%～60%、濃度為8%的丙烯酰胺凝膠[100%濃度定義為 7 mol/L 尿素和40%的去離子甲酰胺]在1×TAE電泳緩沖液中、130 V電壓、60 ℃下電泳7 h。電泳后用銀染10～15 min，掃描并拍照。比對不同處理組和對照組之間差異性條帶，切膠回收、測序比對。測序結果采用DNAstar和Cluster軟件進行序列分析，下載最相似的菌株序列作為系統發育樹的參考序列。然后采用MEGA軟件、Neighbor-Joining法構建系統發育樹，自展數為1 000。主成分分析在CANOCO 4.5軟件中進行。

細菌多樣性指數是研究群落物種數和個體數以及均勻度的綜合指標。根據電泳圖譜中樣品條帶數目及每個條帶的強度(灰度)，對各樣品中細菌香農指數、均勻度、豐富度等指標進行分析。DGGE圖譜采用Quantity one軟件對每個樣品的電泳條帶數目、條帶密度進行數字化分析。

1.3 土壤酶活性及理化性質測定

土壤酶活性測定包括脲酶、磷酸酶、蔗糖酶、過氧化氫酶等的測定，具體操作參考關松蔭的方法[13]。土壤理化性質測定包括速效氮、速效磷、速效鉀、有機質等含量的測定，具體操作參考魯如坤的方法[14]。試驗數據采用Excel處理后作圖，用SPSS 16.0對各處理之間的差異性進行分析。

2 結果與分析

2.1 辣椒根圍細菌DGGE指紋圖譜分析

由表2可知，微生物菌肥“寧盾”處理組相對于對照組，辣椒根圍微生物多樣性呈現下降趨勢，從香農指數、豐富度的結果來看，處理組除了TM組在第2個采樣時間點高于對照組以外，其他所有處理組在3個采樣時間點均低于對照組。說明在施用微生物菌肥后能夠降低辣椒根圍土壤微生物的多樣性，使其中個別微生物成為優勢種群。另外，由于本次試驗采用的是基質栽培，因此，辣椒根圍微生物多樣性總體偏低。

表2 基于DGGE圖譜的土壤樣品微生物多樣性分析

2.2 DGGE圖譜的主成分分析

為了使DGGE結果顯現更加直觀，本試驗中將DGGE圖譜進行量化，根據其灰度進行主成分分析。由圖1可知，在施用微生物菌劑后短時間內，處理組4個品種和對照組辣椒根圍土壤微生物多樣性差異不明顯，但隨著種植時間的延長，處理組中TM、TA組與對照組之間逐漸開始顯現差異性，而TH、TS組無明顯變化，說明微生物菌劑的應用能夠改變辣椒根圍微生物的組成與密度。

2.3 DGGE測序條帶的系統發育樹構建

為明確施用微生物菌劑對辣椒根圍微生物種類的影響，對DGGE指紋圖譜中差異條帶進行切膠測序比對。由圖2可知，在處理組和對照組中有些微生物類群始終處于優勢種群地位，如球形桿菌屬(band6，Sphaerobactersp.)、Dyella屬(band7，Dyellasp.)、鏈霉菌屬(band32，Streptomycessp.)等。另外，使用微生物菌劑后辣椒根圍新出現的微生物類群主要包括類香味菌屬(band12，Myroidessp.)、芽孢桿菌屬(band 36，Bacillussp.)、嗜冷芽孢桿菌屬(band27，Psychrobacillussp.)、赤細菌屬(band28，Erythrobactersp.)等，其中出現最多的為芽孢桿菌屬，芽孢桿菌為微生物菌肥“寧盾”的主要成分。

2.4 土壤酶活性測定結果

由圖3可知，微生物菌肥處理后，在3個采樣時間點，處理組的土壤酶活性相對對照組普遍升高。不同辣椒品種之間土壤酶活性變化差異不大。作為同一品種，紅優4號經過微生物菌肥處理后在3個采樣時間點除蔗糖酶外所有土壤酶活性均明顯高于對照組，其中脲酶活性分別提高20%、12%、21%，磷酸酶活性分別提高29%、31%、33%，纖維素酶活性分別提高100%、180%、265%，過氧化氫酶活性分別提高40%、66%、16%。說明微生物菌肥使用后能夠在一定時期內提高辣椒根圍土壤酶活性。

2.5 土壤主要營養指標測定結果

由圖4可知，微生物菌肥處理組和對照組在3個采樣時間點根圍土壤中氮、磷、鉀及有機質含量變化趨勢基本一致，均呈先降后升的趨勢。但微生物菌肥處理組在3個時間點的主要營養指標含量均高于對照組。不同辣椒品種之間，在微生物菌肥處理后3個時間點氮、磷、鉀及有機質含量差異不大。在同一品種紅優4號中，微生物菌肥處理組與對照組相比水解性氮含量分別提高8%、29%、37%，速效磷含量分別提高21%、48%、0，速效鉀含量分別提高19%、26%、36%，有機質含量分別提高11%、23%、43%。除了處理3個月后時的速效磷含量之外，其他營養指標在3個時間點的提高幅度均呈現上升趨勢。說明在微生物菌肥處理后，能夠在更長時間內為寄主植物提供充足營養。

3 討論與結論

微生物菌肥由于含有能夠協助寄主植物抗病促生的活性有益菌，在施用后能夠在植物根圍有效定殖，且在較長時期內通過提高土壤酶活性、加速土壤中養分循環、抑制病害發生等方面發揮有益作用[15-16]。但對于微生物菌肥的使用方式、對不同土壤條件的適應性以及在不同品種寄主植物上的作用差異等還須要更深入地研究。

本研究通過PCR-DGGE分析方法研究了微生物菌肥“寧盾”在不同辣椒品種上使用后對于寄主根圍細菌多樣性的變化，并測定了相關土壤酶活性以及土壤主要養分含量的變化情況。發現在“寧盾”使用以后，其中主要成分芽孢桿菌能夠在寄主根圍土壤中穩定定殖，且隨著生長期的延長，處理組與對照組在根圍細菌多樣性上開始逐漸呈現差異化。同時，與根圍微生物活性相關的幾種土壤酶活性在處理組中均高于對照組，包括脲酶、過氧化氫酶、蔗糖酶，纖維素酶、磷酸酶等。另外，從辣椒根圍土壤中主要養分指標測定結果來看，處理組均明顯高于對照組，且隨著辣椒生長期的延長，主要營養指標在3個時間點的提高幅度基本呈上升趨勢。說明在微生物菌肥處理后，能夠在更長時間內為寄主植物提供充足營養。從辣椒品種來看，微生物菌肥使用后在不同辣椒品種之間的影響差異不明顯。

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