黃芪莖總黃酮的純化工藝及抗氧化性研究

韓運華， 石 磊

(1.吉林化工學院，吉林吉林 132022； 2.吉林石化公司有機合成廠，吉林吉林 132021)

黃芪是應用非常廣泛的藥食兩用傳統(tǒng)中藥材，為豆科植物膜莢黃芪[Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bunge]和蒙古黃芪[A.membranaceus(Fisch.) Bunge var.mongholicus(Bunge) Hsiao]的干燥根[1]，東北是黃芪的主產(chǎn)區(qū)之一。黃芪的傳統(tǒng)應用部位是根部，黃芪根主要用于氣虛乏力、內(nèi)熱消渴、表虛自汗等病癥的治療[2]，關于黃芪根的藥理活性及化學成分的研究已有較多文獻資料[3-5]。黃芪黃酮是黃芪根中的一類重要活性成分，具有調(diào)節(jié)免疫、清除自由基、抗突變等多種生理活性，主要含有毛蕊異黃酮及苷、芒柄花素、芒柄花苷等活性成分[6-8]。文獻資料表明多種天然黃酮類化合物均具有較好的抗氧化性能、增強人體免疫力、抗衰老等多種生理作用[9-13]。目前，我國主要利用黃芪的根部，大部分黃芪的地上部分即黃芪莖葉被作為廢物丟棄，未被有效利用，使黃芪這一天然資源嚴重浪費，而黃芪莖中含有許多黃酮類化合物，而黃芪總黃酮是黃芪抗氧化、清除自由基的主要活性成分[14-15]，而在很多人類疾病病原體中自由基起著重要的作用[16]，人體內(nèi)如果有大量自由基的生成會引起癌癥、糖尿病等眾多疾病[17-19]，會加快人體的衰老過程[20]，所以引起了人們對黃芪莖的研究興趣，目前市場上已經(jīng)出現(xiàn)了添加黃芪莖粉的畜禽飼料，飼料中添加黃芪莖粉后，對雞、兔具有明顯的促生長作用和增強免疫能力，能夠提高畜禽的生產(chǎn)性能和重大疾患的防治[21]。大孔吸附樹脂是一種具有多孔性、比表面積大的高分子吸附劑，已廣泛應用于天然植物中黃酮類化合物的富集、純化[22-23]。本試驗針對黃芪莖總黃酮的大孔樹脂純化工藝開展試驗研究，達到減少資源浪費，提高農(nóng)民收益的目的，為黃芪莖的綜合利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑 黃芪莖購于吉林省均林中草藥種植有限公司；蕓香苷對照品(供含量測定用，中國食品藥品檢定研究院)；大孔吸附樹脂(ADS-17、XDA-8、LSA-21、LSA-10、AB-8、LX-36、D-101、LSA-33型，西安藍曉科技新材料股份有限公司)；DPPH·(分析純，上海如吉生物科技有限公司)；對氨基苯磺酸(分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司)；2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、鹽酸萘乙二胺(分析純，天津市化學試劑研究所有限公司)；過硫酸鉀、維生素C(分析純，天津市永大化學試劑有限公司)；其他試劑均為市售分析純化學試劑；水為重蒸餾水。

1.1.2 儀器與設備 TU-1810型紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；RE-52C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；SHA-B型水浴恒溫振蕩器(金壇市科析儀器有限公司)；SHB-ⅢA型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；XMTD-8222型電熱鼓風干燥箱(上海精密實驗設備有限公司)。

1.2 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)均為3次重復，取平均值，數(shù)據(jù)分析采用Origin 6.0軟件。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制及樣品含量測定

參照文獻[17]繪制蕓香苷標準曲線[24]。稱取干燥至恒質(zhì)量的蕓香苷9.5 mg，精確稱定，置50 mL容量瓶中，加60%乙醇溶解，定容，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為 0.188 9 mg/mL 的對照品溶液，備用。精確吸取蕓香苷對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置于25 mL容量瓶中，加入0.1 mol/L 的AlCl3溶液5.0 mL，醋酸-醋酸鈉緩沖溶液2.5 mL，60%乙醇定容。40 ℃水浴反應15 min，冷至室溫，以相應的顯色劑溶液為空白，按照紫外可見分光光度法，在406 nm處測定其吸光度。以蕓香苷對照品溶液的吸光度為縱坐標，其質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標，繪制標準曲線，回歸方程：D=27.16C-0.001 1，r=0.999 4。結果表明蕓香苷進樣質(zhì)量濃度在0.003 778～0.037 78 mg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關系。

精確吸取黃芪莖提取液、大孔樹脂吸附后的溶液和解吸液各適量，分別置于25 mL容量瓶中。按上述方法在406 nm處測定上述溶液的吸光度，計算樹脂對黃芪莖總黃酮的比吸附量、吸附率及比解吸量、解吸率和浸膏中總黃酮的含量[25]。計算公式如下：

比吸附量(mg/g)=(C0×V0-C1×V1)/m0；

吸附率=[(C0×V0-C1×V1)/(C0×V0)]×100%；

比解吸量(mg/g)=(V2×C2)/m0；

解吸率={(V2×C2)/[(C0×V0-C1×V1)]}×100%；

干浸膏總黃酮含量=(m2/m1)×100%。

式中：C0為黃芪莖提取液總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；C1為大孔樹脂吸附后溶液總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；C2為解吸液中黃芪莖總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；V0為黃芪莖提取液體積，mL；V1為吸附后溶液體積，mL；V2為解吸液體積，mL；m0為樹脂的稱樣量，g；m1為解吸液干燥后固體的稱樣量，mg；m2為解吸液中總黃酮的測定量，mg。

2.2 大孔吸附樹脂的預處理

稱取LSA-21、ADS-17、LX-36、XDA-8、LSA-10、AB-8、D-101、LSA-33等各種型號的大孔吸附樹脂適量，分別加入到玻璃柱中，參照文獻[26]進行預處理，密封備用[26]。

2.3 黃芪莖提取液的制備

稱取粉碎的黃芪莖30 g，按料液比1 ∶10(g ∶mL)加入70%乙醇水溶液，回流提取2次，每次2 h，過濾，濾液減壓濃縮至相對密度1.18～1.22(60 ℃)的稠膏，加蒸餾水定容至250 mL容量瓶中，備用。

2.4 大孔吸附樹脂的篩選

2.4.1 靜態(tài)吸附與解吸試驗 稱取8種已預處理好的濕樹脂各2 g，分別置于具塞錐形瓶中，隨后分別加入黃芪莖提取液30 mL，在水浴恒溫振蕩器中25 ℃振蕩2 h，靜置48 h，過濾，將過濾后的不同樹脂分別置于具塞錐形瓶中，各加入80%乙醇水溶液50 mL，在水浴恒溫振蕩器中25 ℃振蕩2 h，靜置48 h，過濾。分別吸取各樹脂吸附后的溶液、解吸液各適量，分別加入至25 mL容量瓶中，按“1.3.1”節(jié)方法在406 nm處測定上述各溶液的吸光度，計算各樹脂對黃芪莖總黃酮的比吸附量、吸附率、比解吸量、解吸率[27]。結果(表1)表明，吸附率與解吸率的乘積大于85%的樹脂有3種，分別為 LSA-21、AB-8、D-101，因此選擇上述3種樹脂進行后續(xù)試驗，進一步選擇更加合適的樹脂。

2.4.2 靜態(tài)平衡吸附特征試驗 稱取“2.4.1”節(jié)試驗中篩選出的對黃芪莖總黃酮比吸附量、 比解吸量較好的3種樹脂(AB-8、D-101、LSA-21)各4 g于100 mL錐形瓶中，加入50 mL總黃酮質(zhì)量濃度為0.640 5 mg/mL的黃芪莖提取液，在水浴恒溫振蕩器中25 ℃振蕩，分別于10、30、60、90、120、180、240、300、360、420 min取樣測定上清液的總黃酮質(zhì)量濃度，計算樹脂的比吸附量。然后向吸附420 min的樹脂中加入50 mL的80%乙醇水溶液，在水浴恒溫振蕩器中25 ℃振蕩0.5、1、2、3、4、6、8 h，吸取解吸液適量，測定解吸液的總黃酮質(zhì)量濃度，計算樹脂的比解吸量[28]。分別以3種樹脂(LSA-21、AB-8、D-101)的比吸附量、比解吸量為縱坐標，以吸附時間、解吸時間為橫坐標繪制各樹脂的靜態(tài)吸附動力學曲線，結果見圖1、圖2。

表1 大孔樹脂的選擇試驗結果

由圖1可知，AB-8型樹脂對黃芪莖總黃酮的比吸附量、吸附率隨著吸附時間的延長逐漸升高，在吸附時間為6 h時比吸附量為7.888 mg/g、吸附率為98.51%，LSA-21、D-101型2種樹脂對黃芪莖總黃酮的比吸附量、吸附率在0～4 h內(nèi)均隨著吸附時間的延長而增加，4 h后都基本達到吸附平衡，D-101型樹脂對黃芪莖總黃酮的比吸附量、吸附率分別為7.283 mg/g、90.95%，LSA-21型樹脂對黃芪莖總黃酮的比吸附量、吸附率分別為7.465 mg/g、93.23%，吸附效果依次為AB-8>LSA-21>D-101。對吸附7 h的3種樹脂進行解吸，結果見圖2，由圖2可知，3種樹脂對黃芪莖總黃酮的解吸性能存在一定差異，在0～8 h內(nèi)，3種樹脂對黃芪莖總黃酮的比解吸量及解吸率均隨著解吸時間的延長而逐漸增加。當解吸時間為8 h時，LSA-21、D-101、AB-8型樹脂的比解吸量及解吸率分別為7.017 mg/g、6.355 mg/g、6.762 mg/g，93.89%、86.31%、84.72%。因此綜合權衡上述吸附與解吸的各項數(shù)據(jù)，LSA-21型樹脂在這3種樹脂中具有比解吸量大、解吸率高等優(yōu)點，是本試驗中最合適純化黃芪莖總黃酮的樹脂。

2.5 樹脂的吸附試驗

2.5.1 LSA-21型大孔吸附樹脂的吸附等溫線 稱取12份LSA-21型大孔吸附樹脂，每份4 g，分別置于100 mL錐形瓶中，各加入50 mL總黃酮質(zhì)量濃度不同的黃芪莖提取液，在水浴恒溫振蕩器中25 ℃振蕩24 h，吸取上清液適量，測定其總黃酮質(zhì)量濃度，計算樹脂的比吸附量、吸附率[28]。以 LSA-21樹脂的比吸附量及吸附率為縱坐標，黃芪莖總黃酮的質(zhì)量濃度為橫坐標繪制吸附等溫線，結果見圖3。由圖3可知，隨著黃芪莖總黃酮的質(zhì)量濃度的增加，比吸附量逐漸增加，但吸附率卻逐漸降低， 當黃芪莖總黃酮的質(zhì)量濃度>0.635 mg/mL 時，比吸附量增加幅度較小，但吸附率的下降幅度增大，因為上樣總黃酮的質(zhì)量濃度太低，樹脂的比吸附量較小，不能完全發(fā)揮樹脂的作用，使樹脂嚴重浪費且生產(chǎn)效率低下，而當總黃酮的質(zhì)量濃度達到一定程度后，樹脂的比吸附量雖然持續(xù)增加，但增加趨勢減緩，而且吸附率下降幅度增大，所以總黃酮的質(zhì)量濃度太高，會造成樣液的浪費。綜合考慮LSA-21樹脂吸附黃芪莖總黃酮最大有效上樣液的質(zhì)量濃度為0.635 mg/mL左右，即生藥濃度為0.12 g/mL。

2.5.2 LSA-21型大孔吸附樹脂的泄漏曲線 稱取LSA-21型大孔吸附樹脂15 g，濕法裝柱，加入315 mL總黃酮質(zhì)量濃度為0.639 1 mg/mL的黃芪莖提取液，以1.0 mL/min的流速進行動態(tài)吸附，收集流出液，每15 mL為1個流份，共21個，測定每個流份的總黃酮質(zhì)量濃度。以流份體積為橫坐標，總黃酮質(zhì)量濃度為縱坐標繪制泄漏曲線[29]。以流份的體積為橫坐標，流份中的總黃酮質(zhì)量濃度為縱坐標繪制泄漏曲線，結果見圖4。由圖4可知，隨著黃芪莖提取液上樣體積的增加，流出液中的總黃酮質(zhì)量濃度也逐漸增加，吸附率逐漸降低，當流出液收集到第7個流份(105 mL)的時候，流出液中的總黃酮質(zhì)量濃度已超過黃芪莖提取液總黃酮質(zhì)量濃度的10%，而且吸附率下降幅度增大，結果表明此時已達到泄漏點，建議本試驗中黃芪莖提取液的上樣體積與樹脂質(zhì)量之比(mL ∶g)為7 ∶1，即生藥量/樹脂(g/g)為0.84。

2.5.3 上樣吸附流速的影響 吸取6份總黃酮質(zhì)量濃度為0.643 0 mg/mL的黃芪莖提取液，每份105 mL，分別加入到6根15 g的樹脂柱中，分別以0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL/min 的流速進行吸附，收集流出液，記錄體積，計算比吸附量、吸附率。由表2可知上樣液的吸附流速對樹脂的比吸附量、吸附率有影響，隨著吸附流速的加快，比吸附量、吸附率均逐漸越低，在吸附速率為0.5～1.5 mL/min 范圍內(nèi)，比吸附量、吸附率變化不明顯，吸附流速越慢耗費的時間也就越長，生產(chǎn)周期就越長，為了既保持理想的比吸附量、吸附率又盡量縮短吸附時間，綜合考慮將上樣液吸附流速確定為1.5 mL/min。

表2 上樣吸附流速的試驗數(shù)據(jù)

2.5.4 黃芪莖提取液pH值的影響 吸取7份總黃酮質(zhì)量濃度為0.635 7 mg/mL的黃芪莖提取液，每份105 mL，分別調(diào)pH值為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，然后加入到7根15 g的樹脂柱中，以1.0～1.5 mL/min的流速進行吸附，收集流出液，記錄體積，計算比吸附量、吸附率。由表3可知，黃芪莖提取液pH值在2～6范圍內(nèi)，隨著pH值的升高，樹脂的比吸附量、吸附率緩慢降低，變化相對較小，而當pH值大于6之后，隨著pH值的繼續(xù)升高，樹脂的比吸附量、吸附率明顯降低，變化較大。可能因為黃芪莖提取液中的黃酮類物質(zhì)屬于弱酸性化合物，酸性化合物在酸性溶液中易吸附，所以在pH值在2～6范圍內(nèi)吸附效果比較理想，而提取液的pH值為5.5～6，所以樣品液pH值不需調(diào)節(jié)，后續(xù)試驗直接以初始提取液進行。

表3 黃芪莖提取液pH值的試驗數(shù)據(jù)

2.6 樹脂的解吸試驗

2.6.1 解吸液乙醇體積分數(shù)的影響 吸取6份總黃酮質(zhì)量濃度為0.638 1 mg/mL的黃芪莖提取液，每份105 mL，分別加入到6根15 g的樹脂柱中，控制吸附流速為1.0～1.5 mL/min 進行吸附，收集流出液，記錄體積，計算比吸附量、吸附率。然后分別用0%、10%、30%、50%、70%、90%乙醇水溶液50 mL進行解吸，計算比解吸量、解吸率。試驗結果(表4)表明，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，樹脂的比解吸量、解吸率呈現(xiàn)先逐漸升高的趨勢，當乙醇體積分數(shù)為90%時，比解吸量、解吸率最大，達到2.583 mg/g、64.69%。可能是由于黃芪莖中的黃酮類成分水溶性較小、而脂溶性較大，所以出現(xiàn)了隨著乙醇體積分數(shù)的升高，樹脂的比解吸量、解吸率逐漸升高的現(xiàn)象。

表4 乙醇體積分數(shù)的試驗數(shù)據(jù)

2.6.2 解吸液解吸流速的影響 吸取6份總黃酮質(zhì)量濃度為0.645 2 mg/mL的黃芪莖提取液，每份105 mL，分別加入到6根15 g的樹脂柱中，按“2.5.4”節(jié)方法進行吸附，計算比吸附量、吸附率。然后用90%乙醇水溶液分別以0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL/min的流速進行解吸，計算比解吸量、解吸率。由表5可知，隨著解吸流速的增加，樹脂的比解吸量、解吸率逐漸降低。因為解吸流速過快，解吸性能較差，解吸不完全。但是解吸流速過慢，解吸耗費的時間也就越長，則會使生產(chǎn)周期延長，增加生產(chǎn)成本。而本次試驗結果表明解吸流速在0.5～1.0 mL/min范圍內(nèi)時總黃酮的比解吸量、解吸率變化不大，但當解吸流速 >1.0 mL/min 時總黃酮的比解吸量、解吸率明顯下降。所以將解吸流速確定為 1.0 mL/min，既能使樹脂的比解吸量、解吸率比較理想，又盡量縮短了生產(chǎn)周期。

表5 解吸流速的試驗數(shù)據(jù)

2.6.3 解吸液pH值的影響 吸取6份總黃酮質(zhì)量濃度為0.647 3 mg/mL的黃芪莖提取液，每份105 mL，分別加入到6根15 g的樹脂柱中，按“2.5.4”節(jié)方法進行吸附，計算比吸附量、吸附率。然后分別用pH值為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的90%乙醇水溶液以1.0 mL/min的流速進行解吸，計算比解吸量、解吸率。由表6可知，隨著解吸液pH值的升高，樹脂的比解吸量及解吸率逐漸增大，當pH值大于8之后，隨著pH值的繼續(xù)升高，樹脂的比解吸量及解吸率變化較小。可能因為黃芪莖提取液中的黃酮類物質(zhì)屬于弱酸性化合物，所以更容易被堿性的解吸液洗脫。所以將解吸液調(diào)至pH值為8，以獲得較高的比解吸量及解吸率。

2.6.4 解吸終點的考察 吸取總黃酮質(zhì)量濃度為 0.637 7 mg/mL 的黃芪莖提取液105 mL，加入到15 g的樹脂柱中，按“2.5.4”節(jié)方法進行吸附，計算比吸附量、吸附率。然后用90%乙醇水溶液以1.0mL/min的流速進行解吸，每15 mL為1個流份，共收集12個流份，測定每份解吸液中總黃酮的質(zhì)量濃度，以解吸液中總黃酮質(zhì)量濃度為縱坐標，解吸液體積為橫坐標作圖，確定解吸終點。在該項試驗中，黃芪莖總黃酮的比吸附量為4.013 mg/g、吸附率為89.90%。以解吸液體積為橫坐標，以每份解吸液中總黃酮的質(zhì)量濃度為縱坐標繪制趨勢圖，結果見圖5。由圖5可知隨著解吸液體積的增加，解吸液中的總黃酮質(zhì)量濃度逐漸降低，當收集到第5個流份時，比解吸量、解吸率分別為4.049 mg/g、90.70%，當收集到第8個流份時，比解吸量、解吸率分別為4.229 mg/g、94.74%，而且第8個流份以后解吸液中總黃酮質(zhì)量濃度變化較小。考慮到解吸液體積越大生產(chǎn)成本也就越高，綜合考慮建議本試驗中解吸終點為75 mL，即解吸液體積與樹脂質(zhì)量之比(mL ∶g)為5 ∶1。

表6 解吸液pH值的試驗數(shù)據(jù)

2.7 工藝穩(wěn)定性驗證試驗及黃芪莖脫脂對純化的影響

稱取3份已預處理的LSA-21型樹脂各30 g，濕法裝柱，分別加入黃芪莖提取液210 mL，按“2.5.4”節(jié)方法進行吸附，計算比吸附量、吸附率。然后用3.41 BV的pH值為8.0的90%乙醇水溶液以1.0 mL/min的流速進行解吸。分別吸取90 mL黃芪莖提取液、解吸液，水浴濃縮，放入干燥箱中于 60 ℃ 干燥至恒質(zhì)量。稱取干燥至恒質(zhì)量的黃芪莖干浸膏0.16 g，精確稱定，加60%乙醇20 mL，超聲溶解，過濾，濾液置于50 mL容量瓶中，加60%乙醇定容，作為供試品溶液，備用。吸取供試品溶液適量于25 mL容量瓶中，按“2.1”節(jié)含量測定方法測定干浸膏中總黃酮的質(zhì)量。

稱取粉碎的黃芪莖適量，加入到圓底燒瓶中，按料液比(g ∶mL)1 ∶5加入石油醚(60～90 ℃)，水浴加熱回流2次，每次1 h，過濾，將脫脂后的黃芪莖放于干燥箱中于60 ℃烘干。稱取脫脂后的干燥黃芪莖，按“2.3”節(jié)方法制備黃芪莖提取液，然后按照最佳工藝條件進行吸附-解吸，分別計算比吸附量、吸附率、比解吸量、解吸率及黃芪莖干浸膏中總黃酮的質(zhì)量。

由表7可知，經(jīng)LSA-21型大孔吸附樹脂處理黃芪莖提取液后，黃芪莖總黃酮的比吸附量平均為4.012 mg/g、吸附率平均為88.77%，比解吸量平均為3.645 mg/g、解吸率平均為0.85%。干浸膏中總黃酮含量由4.82%提高到11.04%，總黃酮的富集倍數(shù)為2.29倍。由表7數(shù)據(jù)同時可知，將黃芪莖用石油醚脫脂后，可以使樹脂對黃芪莖總黃酮的比吸附量、比解吸量及干浸膏中總黃酮含量略有提高，但吸附率及解吸率沒有變化。其中干浸膏中總黃酮含量由平均11.04%提高到12.81%。可能因為用石油醚脫脂處理后，除去了黃芪莖中的葉綠素等脂溶性物質(zhì)，結果使提取液中的總黃酮質(zhì)量濃度有所提高，從而使干浸膏中總黃酮含量略有提高。

表7 工藝驗證試驗結果

2.8 乙酸乙酯萃取試驗

將“2.7”節(jié)所得的黃芪莖干浸膏混合，測定其總黃酮的含量，然后用已經(jīng)干燥過的濾紙包好，將濾紙包放在索氏抽提器內(nèi)，按料液比1 ∶40(g ∶mL)加入乙酸乙酯，回流抽提4 h，水浴濃縮回收乙酸乙酯，稠膏放入干燥箱中于60 ℃干燥至恒質(zhì)量，然后按“2.7”節(jié)方法測定，計算乙酸乙酯萃取干浸膏中總黃酮的質(zhì)量。試驗結果表明“2.7”節(jié)所得的黃芪莖干浸膏的總黃酮含量為12.05%，經(jīng)乙酸乙酯萃取后干浸膏中的總黃酮含量提高到24.37%。

2.9 體外抗氧化活性試驗

2.9.1 清除ABTS陽離子自由基試驗 ABTS陽離子自由基水溶液于734 nm波長處有特征吸收峰，當在其溶液中加入抗氧化劑時，ABTS陽離子自由基被清除，溶液吸光度變小，可以得出供試品對ABTS陽離子自由基的清除效果，該方法常用于表征天然產(chǎn)物體外抗氧化活性。稱取干燥的黃芪莖總黃酮(“2.8”節(jié)產(chǎn)物)、蕓香苷、維生素C適量，以50%乙醇為溶劑，配制成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL 的供試品溶液。吸取不同質(zhì)量濃度的供試品溶液各0.1 mL，分別置于10 mL具塞試管中，按文獻[30]操作，在734 nm處測其吸光度D空白、D。按照下式計算黃芪莖總黃酮、蕓香苷、維生素C對ABTS陽離子自由基的清除率[30]。

ABTS陽離子自由基清除率=[(D空白-D)/D空白]×100%。

式中：D空白為ABTS自由基陽離子工作液在波長734 nm處的吸光度；D為供試品溶液與ABTS自由基陽離子工作液反應后的吸光度。

以質(zhì)量濃度為橫坐標，清除率為縱坐標作圖，得到各供試品質(zhì)量濃度與ABTS陽離子自由基清除率的關系，試驗結果見圖6。由圖6可知，隨著各供試品質(zhì)量濃度的增加，對ABTS陽離子自由基的清除率均逐漸升高，維生素C的清除率最高，黃芪莖總黃酮的清除率最低，當質(zhì)量濃度為 0.6 mg/mL 時，黃芪莖總黃酮、蕓香苷、維生素C對ABTS陽離子自由基的清除率分別為74.48%、84.09%、90.07%。

2.9.2 清除亞硝酸鹽試驗 在一定的條件下，亞硝酸鈉與對氨基苯磺酸及鹽酸萘乙二胺反應生成的紅色絡合物在 538 nm 波長處有特征吸收峰。在其他條件相同的情況下，可以通過在538 nm處吸光度的大小反映供試品清除亞硝酸鹽能力的高低。吸取“2.9.1”節(jié)試驗中不同質(zhì)量濃度的供試品溶液各 1.0 mL， 置于10 mL具塞試管中， 分別加 10 μg/mLNaNO2溶液2.5 mL，在37 ℃恒溫水浴中反應30 min，取出后立即加入0.5 mL 0.4%對氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置15 min后加入0.2%鹽酸萘乙二胺溶液0.25 mL，加入蒸餾水7 mL，混勻，靜置15 min。50%乙醇作空白，于538 nm波長處測定吸光度Di[31]。其他條件不變，不加供試品溶液，按照上步試驗，于538 nm波長處測定吸光度D0。按照下式計算黃芪莖總黃酮、蕓香苷、維生素C對亞硝酸鹽的清除率：

亞硝酸鹽清除率=[(D0-Di+Dj)/D0]×100%。

式中：Di為加入供試品溶液的吸光度；Dj為供試品溶液的本底值；D0為不加供試品溶液的對照值。

以質(zhì)量濃度為橫坐標、清除率為縱坐標作圖，得到各樣品質(zhì)量濃度與亞硝酸鈉清除率的關系。由圖7可知，隨著各供試品質(zhì)量濃度的升高，對亞硝酸鹽的清除率均逐漸上升，當質(zhì)量濃度達到0.6 mg/mL時黃芪莖總黃酮、蕓香苷、維生素C對亞硝酸鹽的清除率分別達到93.29%、90.09%、95.03%，其清除能力維生素C>黃芪莖總黃酮>蕓香苷，但總體而言三者對亞硝酸鹽的清除能力相差不明顯。

3 結論與討論

本試驗以總黃酮的比吸附量、吸附率和比解吸量、解吸率為考察指標，對大孔吸附樹脂純化黃芪莖總黃酮的工藝條件進行了探索，比較了ADS-17、XDA-8、LSA-21、LSA-10、AB-8、LX-36、D-101、LSA-33等8種大孔吸附樹脂對黃芪莖總黃酮的分離純化效果，結果表明，LSA-21型大孔吸附樹脂比較適合純化黃芪莖中的黃酮類化合物，它對黃芪莖總黃酮的比吸附量平均為4.012 mg/g、吸附率平均為88.77%，比解吸量平均為3.645 mg/g、解吸率平均為0.85%。通過靜態(tài)、動態(tài)吸附和解吸試驗，考察了黃芪莖總黃酮在LSA-21型樹脂上的吸附特性，確定LSA-21型樹脂純化黃芪莖總黃酮的工藝條件為：提取液控制其生藥濃度為0.12 g/mL；黃芪莖提取液的上樣體積與樹脂質(zhì)量之比(mL ∶g)為7 ∶1，即生藥量/樹脂(g/g)為0.84；吸附流速控制為1.5 mL/min；解吸液為90%乙醇水溶液；解吸流速控制為1.0 mL/min；解吸液pH值為8；解吸液體積與樹脂質(zhì)量之比(mL ∶g)為5 ∶1。在上述純化工藝條件下，黃芪莖提取液經(jīng)LSA-21型大孔吸附樹脂純化后，黃芪莖干浸膏中總黃酮含量由4.82%提高到11.04%，總黃酮含量提高了約1.29倍，黃芪莖采用石油醚脫脂后，黃芪莖干浸膏中總黃酮含量可以提高到12.81%，乙酸乙酯萃取后黃芪莖干浸膏中總黃酮含量由12.05%提高到24.37%。體外抗氧化活性的試驗結果表明：黃芪莖總黃酮對亞硝酸鹽、ABTS陽離子自由基均具有清除活性，而且均隨著其質(zhì)量濃度的增加，清除活性均明顯增強。上述試驗結果為黃芪莖總黃酮在食品、飲料、制藥等領域的應用提供了工作基礎。

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