大孔樹脂聯(lián)合硅膠柱純化核桃枝中胡桃醌的條件

吳 琴， 丁 杰

(四川理工學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院，四川自貢 643000)

核桃，又名胡桃，胡桃科屬，《本草綱目》中記載到，核桃除果仁可以食用外，其青皮、枝皮、殼等部位都可作藥用[1]。胡桃醌，又名核桃醌，是一種存在于核桃枝皮、核桃青果皮等部位的活性物質(zhì)，具有抗腫瘤[2]、抗癌[3]、抑菌[4]、殺蟲[5]等多種生物活性。近年來，關(guān)于核桃中胡桃醌的研究報道較多，主要集中在對核桃殼、青果皮等部位的研究。郭瑜等采用超聲波輔助提取結(jié)合響應(yīng)面法分析核桃殼中的胡桃醌，得到最佳提取條件為：溫度45 ℃，時間1.4 h，超聲功率250 W，料液比1 g ∶24 mL，在此條件下核桃殼中胡桃醌的提取率為 8.150 3%[6]。馮遲等以青果皮為原料，通過單因素試驗優(yōu)選出胡桃醌的最佳提取工藝，其提取率可達1.72 mg/g[7]。馬樂等采用D101大孔樹脂來純化核桃青皮中的胡桃醌，利用HPLC鑒定和分析純度，結(jié)果表明，D101大孔樹脂對胡桃醌具有較好的分離純化效果[8]。而許紹慧等通過對核桃枝皮中化學(xué)成分的研究，發(fā)現(xiàn)胡桃醌在其中的含量相對較高，達到1 g ∶(2.5～50.4) kg(鮮質(zhì)量)[9]。為更好利用核桃枝皮資源，提高胡桃醌的藥用和經(jīng)濟價值，本研究以核桃枝為原料，擬采用大孔樹脂聯(lián)合硅膠柱對胡桃醌進行富集純化，通過單因素試驗優(yōu)選純化胡桃醌的工藝條件，對綜合利用和合理開發(fā)核桃枝具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃枝采自四川省內(nèi)江市資中縣；胡桃醌對照品，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；D101、HPD-300、HPD-100、HPD-600、NKA-9、DM301大孔樹脂，北京英萊克科技發(fā)展有限公司；95%乙醇、乙酸乙酯、甲醇(分析純)等試劑均購自成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

玻璃柱(2.6 cm×30.5 cm、1.7 cm×30.5 cm)，北京欣維爾；OSB-2100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司；KQ-300E超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)搖床，武漢瑞華儀器設(shè)備有限公司；UV-1800PC紫外可見分光光度計，翱藝儀器(上海)有限公司；CP114電子分析天平，奧豪斯儀器(上海)有限公司；LC3000型高效液相色譜儀，創(chuàng)新通恒科技有限公司；色譜柱：Welchrom C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。

1.3 胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

1.3.1 紫外-可見光度法 精確稱取胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)品 11.1 mg，甲醇溶解后，定容至25.0 mL容量瓶中作為母液，再分別配制0.177 6、1.776 0、10.660 0、22.200 0、26.640 0、44.400 0 mg/L 的不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液，在420 nm波長下測吸光度，以濃度-吸光度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為y=0.015 6x-0.000 7(r2=0.999 2)。表明胡桃醌濃度在0.177 6～44.400 mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

1.3.2 HPLC法 取“1.3.1”節(jié)下母液配制濃度為9.440、28.320、47.200、61.360、75.520 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)液，按照流動相：甲醇 ∶水=70 ∶30(體積比)(色譜柱：Welchrom C18柱，4.6 mm×250 mm，5 μm)；洗脫速度：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長：250 nm進樣測定，以測得的峰面積-濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為：y=25 042x+195 771(r2=0.999 2)。表明胡桃醌濃度在9.440～75.520 mg/L 的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

1.4 樣品液制備

傳統(tǒng)的胡桃醌提取中用到的提取劑主要是乙醇水溶液、甲醇水溶液或純的乙醇、甲醇、丙酮等單一溶劑，它們的極性都非常接近或很大，因此，作為提取劑時，所得的粗提物中雜質(zhì)成分多且與目標(biāo)物極性相似，使得胡桃醌后期的分離純化難度增加。故而通過使用混合溶劑來改變提取劑體系的極性，從而得到易于純化的粗提物。

選用實驗室常用的二氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚與95%乙醇配比作為提取劑提取胡桃醌，再與單一的95%乙醇、甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷做為提取劑進行對比，結(jié)果乙酸乙酯-95%乙醇(體積比1 ∶1)對胡桃醌的提取效果最佳，因此選擇乙酸乙酯-95%乙醇(體積比1 ∶1)為制備樣品液的提取溶劑。樣品液制備步驟如下：

稱取200.0 g核桃枝粉末，以5 000 mL乙酸乙酯-95%乙醇(體積比1 ∶1)為溶劑，在35 ℃下超聲提取2次，每次 45 min，合并濾液，在35 ℃下減壓蒸餾除去溶劑，濃縮為浸膏備用。

1.5 大孔樹脂預(yù)處理

新購買的大孔樹脂內(nèi)孔里面通常會有氣泡或殘留部分有機物和惰性溶劑，為防止在使用時有害物對樹脂造成污染和產(chǎn)生過多的氣泡，在使用前必須經(jīng)過預(yù)處理。參照劉宛玲等的方法[10]，先用95%乙醇浸泡大孔樹脂24 h以除去脂溶性雜質(zhì)，水洗至無醇味，再以5% NaOH溶液和5% HCl溶液分別浸泡3 h對樹脂進行活化，水洗至中性，水封備用。

1.6 大孔樹脂選擇

1.6.1 靜態(tài)吸附試驗 取處理好的6種不同型號的大孔樹脂，過濾，分別稱取3.0 g置于6個相同型號的錐形瓶中，同時加入濃度為29.47 mg/L的胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)品甲醇溶液 20.0 mL，密封，置于搖床(28 ℃，150 r/min)上振搖3 h，取上清液在紫外分光光度計下測吸光度，計算吸附率[11]。計算公式如下：

式中：E為吸附率(%)；C0、C1為吸附前后藥液中胡桃醌的質(zhì)量濃度(mg/L)。

1.6.2 靜態(tài)解吸試驗 將吸附后的樹脂過濾，并用蒸餾水清洗2遍，再分別放入6個相同型號的錐形瓶中，加入20.0 mL 95%乙醇在相同條件的搖床上振搖解吸3 h，取上清液在紫外分光光度計下測吸光度，計算解吸率。

式中：D為解吸率(%)；C2為解吸后藥液中胡桃醌的質(zhì)量濃度(mg/L)；C0、C1為吸附前后藥液中胡桃醌的質(zhì)量濃度(mg/L)；V1為吸附液體積(L)；V2為解吸液體積(L)。

1.7 HPD-100大孔樹脂純化胡桃醌的動態(tài)吸附與解吸工藝

1.7.1 上樣濃度的選擇 取適量篩選出的理想樹脂，濕法裝柱。配制不同質(zhì)量濃度的上樣液(19.21、23.38、27.55、36.07、39.21 mg/L)各100 mL，以1.0 mL/min的流速上柱吸附，收集流出液，濃縮，紫外分光光度計下測吸光度，計算吸附率。

1.7.2 上樣流速的選擇 取適量篩選出的理想樹脂，濕法裝柱。配制500.0 mL濃度為36.07 mg/L的上樣液，分別取100.0 mL以不同流速(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL/min)上柱吸附，收集流出液，濃縮，紫外分光光度計下測吸光度，計算吸附率。

1.7.3 上樣量的選擇 取適量篩選出的理想樹脂，濕法裝柱。配制濃度為36.07 mg/L的上樣液，以1.5 mL/min的速度上柱吸附，流出液每10 mL收集1份，濃縮，紫外分光光度計下測吸光度，計算胡桃醌質(zhì)量濃度，繪制泄露曲線。

1.7.4 洗脫劑的選擇 取適量篩選出的理想樹脂，濕法裝柱。按最佳吸附條件進行上樣，以1 BV蒸餾水洗脫除雜，取甲醇、95%乙醇溶液各100.0 mL，以1.0 mL/min的速度進行洗脫，收集洗脫液，濃縮，甲醇定容，紫外分光光度計下測吸光度，計算解吸率。

1.7.5 洗脫劑體積分數(shù)的選擇 取適量篩選出的理想樹脂，濕法裝柱。按最佳吸附條件進行上樣，以1 BV蒸餾水洗脫除雜，分別用20%、40%、60%、80%、95%乙醇溶液各 100.0 mL，以1.0 mL/min的速度進行洗脫，收集洗脫液，濃縮，甲醇定容，紫外分光光度計下測吸光度，計算解吸率。

1.7.6 洗脫劑流速的選擇 取適量篩選出的理想樹脂，濕法裝柱。按最佳吸附條件進行上樣，以1 BV蒸餾水洗脫除雜，分別用80%乙醇溶液各100.0 mL以不同流速(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL/min)進行洗脫，收集洗脫液，濃縮，甲醇定容，紫外分光光度計下測吸光度，計算解吸率。

1.7.7 洗脫劑用量的選擇 取適量篩選出的理想樹脂，濕法裝柱。按最佳吸附條件進行上樣，以1 BV蒸餾水洗脫除雜，再用80%乙醇溶液以2.5 mL/min的速度進行洗脫，每10 mL收集1份，濃縮，甲醇定容，紫外分光光度計下測吸光度，計算胡桃醌質(zhì)量濃度，繪制洗脫曲線。

1.8 大孔樹脂與硅膠柱聯(lián)合純化方法

取樣品150.0 mg溶解于甲醇中，按最佳吸附條件上樣，最佳解吸條件洗脫，收集洗脫液，在35℃條件下減壓濃縮。向濃縮液中加入硅膠拌樣使樣品吸附在硅膠上，并烘干呈粉末狀，干法上樣，以石油醚和二氯甲烷(體積比1 ∶0，1 BV；體積比2 ∶1，3 BV；體積比1 ∶1，3 BV；體積比1 ∶2，3 BV；體積比0 ∶1，3 BV)進行洗脫，每10 mL收集1份，通過薄層檢驗，與標(biāo)準(zhǔn)品進行對照，合并含胡桃醌的組分，旋干稱質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹脂選擇結(jié)果

從表1可以看出，6種大孔樹脂對胡桃醌的吸附效果依次為HPD-300>HPD-100>D101>NKA-9>DM301>HPD-600，解吸效果依次為DM301>HPD-600>HPD-100>D101>NKA-9>HPD-300，結(jié)果表明，大孔樹脂對胡桃醌的吸附和解吸選擇性差異較大，綜合考慮選擇HPD-100為此次試驗的最佳樹脂。

表1 6種大孔樹脂靜態(tài)吸附和解吸結(jié)果

2.2 動態(tài)吸附與解吸工藝

2.2.1 上樣濃度的選擇 從圖3可以看出，胡桃醌吸附率隨著上樣濃度的增加先升高后降低，可能是因為濃度在低于36.07 mg/L時，單位表面積內(nèi)樹脂與胡桃醌接觸量小，對胡桃醌的吸附未達到飽和狀態(tài)，而在超過36.07 mg/L濃度后，上樣液中雜質(zhì)較多且樹脂達到飽和態(tài)使吸附能力減弱，故選擇36.07 mg/L為最佳上樣濃度。

2.2.2 上樣流速的選擇 從圖4可以看出，吸附率隨著上樣流速的增加，變化差距不大，在1.5 mL/min的流速下吸附率最大，在2.5 mL/min后吸附率開始明顯降低，可能是因為上樣速率過快而使上樣液與樹脂未充分接觸，綜合考慮選擇1.5 mL/min為上樣流速。

2.2.3 上樣量的選擇 從圖5可以看出，當(dāng)上樣液體積達到50 mL時，流出液中胡桃醌的濃度約為初始濃度的1/10，在80 mL時趨于完全泄露的狀態(tài)，此時樹脂已吸附飽和，因而確定最大上樣體積為50 mL。

2.2.4 洗脫劑的選擇 從圖6可以看出，用95%乙醇進行洗脫，其解吸效果明顯好于甲醇，故而選擇95%乙醇為最佳洗脫劑。

2.2.5 洗脫劑體積分數(shù)選擇 胡桃醌是一種易溶于乙醇、甲醇、氯仿等有機溶劑而較難溶于水的萘醌類化合物。從圖7可以看出，當(dāng)乙醇體積分數(shù)越大時，胡桃醌越容易從樹脂上解吸下來，而當(dāng)洗脫劑中乙醇體積分數(shù)超過80%時其解吸率開始減小，可能是因為80%乙醇體積分數(shù)適中，與胡桃醌極性相似，在這個體積分數(shù)下胡桃醌已大部分被洗脫下來，因而80%乙醇洗脫效果最佳。

2.2.6 洗脫劑流速選擇 從圖8可以看出，以2.5 mL/min的洗脫速率進行洗脫效果最佳。因為洗脫速度太慢，可能會導(dǎo)致洗脫時間較長，而洗脫速度太快，又可能會使洗脫劑與樹脂接觸時間不夠，使胡桃醌洗脫不下來[12]。

2.2.7 洗脫量的選擇 從圖9可以看出，當(dāng)洗脫劑用量達到150 mL時，流出液中胡桃醌的濃度接近0，故將此點作為洗脫終點。

2.3 純化后核桃枝中胡桃醌的HPLC分析

將純化前后的胡桃醌及標(biāo)準(zhǔn)品溶解后進行HPLC分析，其HPLC圖譜及純化前后含量對比見表2、圖10。

從圖10、表2可以看出，經(jīng)過HPD-100大孔樹脂和硅膠柱聯(lián)合純化后的胡桃醌周圍雜質(zhì)峰數(shù)目及高度明顯減少，純度提高了60%，表明此方法對胡桃醌的純化效果較好。

表2 胡桃醌純化前后含量比較

3 結(jié)論與討論

大孔樹脂是一種選擇性好、吸附容量大且相對穩(wěn)定的聚合物吸附劑，廣泛應(yīng)用于多酚、黃酮、生物堿、醌類等天然產(chǎn)物的分離純化。本研究結(jié)果表明，HPD-100型大孔樹脂純化胡桃醌的最佳條件參數(shù)為：上樣濃度36.07 mg/L，上樣流速1.5 mL/min，上樣量為50 mL；洗脫劑濃度為80%乙醇，洗脫速率2.5 mL/min，洗脫體積150 mL。聯(lián)合硅膠柱純化后，胡桃醌純度提高了60%。本試驗結(jié)果與王炎研究結(jié)論[13]比較，采用聯(lián)合柱層析法來純化胡桃醌，同時用HPLC來檢測胡桃醌純化前后的含量，客觀說明該試驗方法的可行性和試驗結(jié)果的可靠性，且該法成本低廉，可在核桃枝中胡桃醌的純化研究中進行開發(fā)和利用。

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