微波-超聲聯合提取參數對黃秋葵多糖和黃酮得率的影響

劉春菊， 王海鷗， 唐明霞， 李大婧， 劉春泉， 張鐘元， 江 寧， 牛麗影， 袁春新

(1.江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇南京 210014； 2.國家蔬菜加工技術研發專業分中心，江蘇南京 210014；3.南京曉莊學院食品科學學院，江蘇南京 211171； 4.江蘇沿江地區農業科學研究所，江蘇如皋 226541)

黃秋葵[Abelmoschusesculentus(L.) Moench]是錦葵科秋葵屬一年生草本植物，被譽為素菜之王，富含蛋白質、維生素、礦物質等營養物質及多糖、黃酮、果膠、鋅和硒等功能成分，具有抗氧化、防止衰老、抗腫瘤、降血脂等作用，具有較高的食用價值和藥用價值[1-3]。隨著黃秋葵的特殊食用、藥用功效日漸被人們認識和了解，受到了許多專家學者的極大關注，其中在黃秋葵多糖和黃酮方面的研究表現得尤為突出。國內外研究發現，黃秋葵中含有一種黏性多糖，它是由阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖等構成的多糖與蛋白質形成的共價復合物，具有助消化、增強免疫力、抗腫瘤、降血脂等功效[4-5]。黃秋葵還富含黃酮類化合物，黃酮類物質是公認的天然抗氧化劑，具有降脂、抗心血管疾病、消除自由基以及抗氧化、抗骨質疏松、防癌抗癌等作用[6]。

植物中多糖和黃酮類化合物的提取方法主要包括沸水浸提法、微波輔助提取法、超聲輔助提取法。近年來，微波、超聲輔助提取技術在植物有效成分提取方面的應用廣泛，超聲波可利用其空化效應加快介質分子的運動速度，從而使可溶性活性成分迅速溶出[7]。微波輔助提取主要利用介電加熱和離子傳導作用，即利用離子在微波作用下的劇烈運動，使物質中的成分溢出，從而達到快速提取的目的。微波、超聲輔助提取都具有溶劑用量少、提取時間短、提取溫度低等優點[8]，但一般都是單獨輔助提取1種有效成分，聯合2種技術提取2種以上有效成分的研究尚未見報道，因此，本研究以黃秋葵老蒴果為原料，采用微波-超聲輔助技術聯合提取黃秋葵中的多糖和黃酮，研究微波提取料液比、微波提取功率、微波提取時間、超聲提取乙醇體積分數、超聲提取料液比、超聲提取功率、超聲提取溫度、超聲提取時間對黃秋葵多糖和黃酮得率的影響，以期為黃秋葵功能活性物質的綜合提取提供技術支撐和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

黃秋葵品種為卡里巴，于2016年10月采自南通盛泰農業發展有限公司黃秋葵種植基地，選取不能食用的黃秋葵老蒴果作為試驗樣品。

1.2 儀器與試劑

UV-6300型紫外可見分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)；BS224S電子分析天平(北京賽多利斯科學儀器公司)；TG16-WS臺式高速離心機(湖南長沙湘儀離心機儀器有限公司)；WP800SL23-2格蘭仕微波爐(佛山市順德區格蘭仕微波爐電器有限公司)；KQ-S1000VDE型三頻數控超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司)；真空冷凍干燥機(江蘇博萊客冷凍科技發展有限公司)；FW100高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)；HH-8恒溫水浴鍋(金壇市環保儀器廠)。葡萄糖、蕓香苷標準品購于中國藥品生物制品檢定所；無水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、蒽酮、硫酸等均為分析純。

1.3 黃秋葵凍干粉制備

當天采摘的黃秋葵老蒴果經過清洗、切片后，平鋪于物料盤上，將冷凍盤放入冷凍干燥設備中，當物料溫度達到-30～-40 ℃時冷凍1～2 h，抽真空直至凍干倉真空度達到30 Pa以下，打開加熱板開關，進行真空冷凍干燥，待黃秋葵中心溫度與加熱板溫度一致時干燥結束。將凍干黃秋葵采用粉碎機研磨成粉，過80目篩，獲得黃秋葵凍干粉，置于-20 ℃環境中低溫保存。

1.4 微波-超聲聯合提取工藝

準確稱取黃秋葵凍干粉0.20 g，以料液比1 g ∶100 mL加入蒸餾水混勻，用528 W微波功率提取4 min，每次20 s，中間停2 min，微波提取后離心，獲得上清液1和沉淀1。在上清液1中加入無水乙醇，使乙醇濃度達到80%，置于4 ℃冰箱中靜置過夜，離心后棄去上清液獲得沉淀2，取沉淀2用適量蒸餾水溶解，定容后獲得多糖提取液。向沉淀1中以料液比1 g ∶30 mL加入70%乙醇溶液，混勻后以超聲波功率 600 W，70 ℃超聲40 min，離心得到上清液2，然后用70%乙醇定容后獲得黃酮提取液。

1.5 多糖和黃酮測定方法

采用蒽酮-硫酸比色方法[9]測定多糖的含量；采用亞硫酸鈉-硝酸鋁分光光度方法[10]測定黃酮的含量。測得提取液多糖、黃酮含量后，按照式(1)計算多糖、黃酮得率：

(1)

式中：m1為多糖或黃酮提取液中多糖或黃酮含量，g；m為黃秋葵粉的質量，g。

1.6 試驗設計

固定基本提取參數，分別考慮微波提取料液比(1 g ∶50 mL、1 g ∶75 mL、1 g ∶100 mL、1 g ∶125 mL、1 g ∶150 mL)、微波提取功率(136、320、528、680、760 W)、微波提取時間(2、3、4、5、6 min)、超聲提取乙醇體積分數(50%、60%、70%、80%、90%)、超聲提取料液比(1 g ∶10 mL、1 g ∶20 mL、1 g ∶30 mL、1 g ∶40 mL、1 g ∶50 mL)、超聲提取功率(400、600、800、1 000 W)、超聲提取溫度(40、50、60、70、80 ℃)、超聲提取時間(20、30、40、50、60 min)。

1.7 數據處理

所有數據采用SPSS 19.0統計軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，由Tukey分析均值差異的顯著性，顯著水平0.05。

2 結果與分析

2.1 微波提取料液比對黃秋葵多糖、黃酮得率的影響

由表1可以看出，隨著料液比的增加，黃秋葵多糖得率整體呈增加趨勢，在料液比達到1 g ∶100 mL時多糖得率最高，為2.95%，料液比從1 g ∶50 mL增加到1 g ∶100 mL，多糖得率提高0.8倍，料液比繼續增加，多糖得率變化不顯著(P>0.05)，這可能是因為隨著料液比的增加，黃秋葵中多糖的擴散速度逐漸增大，提取液的黏度逐漸減小，對多糖的溶出起促進作用[11]。此外，隨著蒸餾水添加量的增加，過多的蒸餾水使其他雜質大量溶出，使多糖得率變化不大[9]。隨著料液比的增加，黃酮的得率逐漸下降，這可能是由于隨著微波提取料液比的增加，溶出的多糖得率增加，少量黃酮也會隨之溶出，造成沉淀中的黃酮量減少，導致黃酮得率逐漸降低。綜合考慮多糖得率和黃酮得率，將微波提取料液比確定為 1 g ∶100 mL 較為合適。

表1 微波提取料液比對黃秋葵多糖、黃酮得率的影響

注：同列數據后不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下表同。

2.2 微波提取功率對黃秋葵多糖、黃酮得率的影響

從表2可以看出，黃秋葵多糖得率整體上隨著微波功率的增大而增加，當微波功率達到528 W后，隨著微波功率的繼續增大，多糖得率變化不顯著(P>0.05)，微波功率從 136 W 增大到528 W，多糖得率提高0.3倍，可能是由于微波輻射使得黃秋葵的細胞遭到破壞，多糖容易溶出，隨著微波功率的增大，溫度升高，分子的運動速度加快，部分多糖在高溫條件下發生水解[12]。黃酮得率隨著微波功率的增大而增加，這可能是由于微波功率增大對細胞產生的破壞，在超聲提取時可促使黃酮溶出量的增加[13]。因此，確定最佳微波提取功率為528 W。

表2 微波提取功率對黃秋葵多糖、黃酮得率的影響

2.3 微波提取時間對黃秋葵多糖、黃酮得率的影響

從表3可以看出，隨著微波提取時間的增加，黃秋葵多糖得率呈先增加后減少的變化趨勢，當微波提取時間為4 min時，多糖得率達到最大值，提取時間繼續增加，多糖得率有所減少；隨著微波提取時間的增加，黃酮得率呈先增加后減少的變化趨勢，在提取時間為4 min時黃酮得率達到最大值，繼續增加提取時間，黃酮得率急劇下降，微波提取時間從2 min增加到4 min，多糖得率和黃酮得率都提高0.4倍。這可能是由于短時間內的微波輻射對細胞的破碎作用較大，使得多糖溶出較多，較長時間的微波輻射使多糖的穩定性下降[14]，并且隨著提取時間的延長，細胞破碎得更完全，其他物質也同時被提取出來[15]。因此，微波提取時間為4 min時黃秋葵多糖、黃酮得率最高。

表3 微波提取時間對黃秋葵多糖、黃酮得率的影響

2.4 超聲提取乙醇體積分數對黃秋葵黃酮得率的影響

從表4可以看出，隨著乙醇體積分數的增加，黃秋葵黃酮得率先增加后減少，在乙醇體積分數為80%時，黃酮得率達到最大值，這與孫鮮明等從流蘇花中超聲提取總黃酮的研究結果[16]一致。這可能是由于黃酮類化合物具有較高的極性，乙醇體積分數的增加可使黃酮更好地溶出[13]。但當乙醇體積分數超過80%后，黃酮類化合物達到飽和，同時一些親脂性雜質成分的溶出量增加，這些成分與黃酮類化合物競爭性溶出，從而導致黃酮類化合物得率下降[17]。因此，最佳超聲提取乙醇體積分數為80%。

表4 超聲提取乙醇體積分數對黃秋葵黃酮得率的影響

2.5 超聲提取料液比對黃秋葵黃酮得率的影響

從表5可以看出，黃秋葵黃酮得率整體上隨著超聲提取料液比的增加而增加，當料液比達到1 g ∶20 mL時，黃酮得率達到最大值，料液比從1 g ∶10 mL增加到1 g ∶20 mL，黃酮得率提高0.3倍，繼續增加料液比，黃酮得率變化不顯著(P>0.05)，這可能由于隨著料液比的增加，黃酮類物質與乙醇溶液的接觸面積增大，從而使得黃酮類物質可以充分溶解出來，但料液比的繼續增加，可使除了黃酮以外的雜質也被溶解出來，對黃酮得率產生影響[15]。綜合考慮，確定的最佳超聲提取料液比為1 g ∶20 mL。

表5 超聲提取料液比對黃秋葵黃酮得率的影響

2.6 超聲提取功率對黃秋葵黃酮得率的影響

從表6可以看出，黃秋葵黃酮得率整體隨著超聲提取功率的增大而增加，在800 W時達到最大值，超聲功率從400 W增大到800 W，黃酮得率提高0.2倍，繼續增加超聲功率，黃酮得率變化不顯著(P>0.05)。這可能是由于隨著超聲功率的增大，黃秋葵細胞壁的破損程度增大，在800 W后黃秋葵中的細胞組織已全部破碎變形，黃秋葵中黃酮幾乎全部被提取出來，使得繼續增大提取功率時黃酮的提取率變化不顯著(P>0.05)。綜合考慮超聲提取功率為800 W較合適。

表6 超聲提取功率對黃秋葵黃酮得率的影響

2.7 超聲提取溫度對黃秋葵黃酮得率的影響

從表7可以看出，黃秋葵黃酮得率整體上隨著超聲提取溫度的升高先增加后減少，在溫度為70 ℃時達到最大值，提取溫度從40 ℃升高到70 ℃，黃酮得率提高0.4倍，繼續增加提取溫度，黃酮得率下降，這可能是由于黃酮在乙醇中的溶解度在一定范圍內隨溫度的升高而增加，同時由于溫度逐漸升高，提取液黏度減小，擴散系數增加，促使提取速度加快[18]，但過高的溫度容易使黃酮類化合物氧化，并且其他雜質的溶出也會增多。因此，最佳超聲提取溫度為70 ℃。

表7 超聲提取溫度對黃秋葵黃酮得率的影響

2.8 超聲提取時間對黃秋葵黃酮得率的影響

從表8可以看出，黃秋葵黃酮得率整體上隨著超聲提取時間的增加而增加，在提取時間為50 min時達到最大值，提取時間從20 min增加到50 min，黃酮得率提高0.3倍，繼續增加超聲時間，黃酮得率變化不明顯。這可能是由于在一定范圍內增加提取時間，可以使黃秋葵原料與乙醇的接觸時間增加，從而使黃酮在溶液中的溶解度增加，當超聲時間超過50 min時，溶質大量揮發，原料中的其他醇溶性物質也會被溶解并提取出來，對黃酮的提取與測定產生影響[19]。因此，超聲提取時間為50 min較合適。

表8 超聲提取時間對黃秋葵黃酮得率的影響

3 結論

不同微波提取參數對黃秋葵多糖、黃酮得率具有明顯影響，其中黃秋葵多糖得率隨著微波提取料液比的增加整體呈增加趨勢，從1 g ∶50 mL增加到1 g ∶100 mL，多糖得率提高0.8倍；黃酮得率隨著微波提取料液比的增加而逐漸減少。黃秋葵多糖、黃酮得率整體上隨著微波提取功率的增大而增加，其中微波功率從136 W增加到528 W，多糖得率提高0.3倍。隨著微波提取時間的增加，黃秋葵多糖、黃酮得率先增加后減少，當提取時間為4 min時，達到最大值。

不同超聲提取參數對黃秋葵黃酮得率影響明顯，隨著超聲提取乙醇體積分數的增加，黃秋葵黃酮得率先增加后減少，當乙醇體積分數為80%時，黃酮得率達到最大值；黃秋葵黃酮得率整體上隨著超聲提取料液比的增加而增加，從料液比 1 g ∶10 mL 增加到1 g ∶20 mL，黃酮得率提高0.3倍；隨著超聲提取功率的增加，黃秋葵黃酮得率整體呈增加趨勢，超聲功率從400 W增加到800 W，黃酮得率提高0.2倍；隨著超聲提取溫度的增加，黃秋葵黃酮得率先增加后減少，當溫度為 70 ℃ 時，黃酮得率達到最大值；隨著超聲提取時間的增加，黃秋葵黃酮得率整體呈增加趨勢，當提取時間為50 min時，達到最大值。

微波-超聲聯合提取黃秋葵多糖和黃酮的最佳工藝：微波提取料液比為1 g ∶100 mL，微波提取功率為528 W，微波提取時間為4 min，超聲提取乙醇體積分數為80%，超聲提取料液比為1 g ∶20 mL，超聲提取功率為800 W，超聲提取溫度為70 ℃，超聲提取時間為50 min。

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