木質素降解菌BP01的篩選、鑒定及其產酶特性

姜立春， 趙麗萍，楊 萍， 王 婷， 李小芳， 朱 靜， 阮期平

(綿陽師范學院分子生物學與生物制藥重點實驗室，四川綿陽 621000)

木質素(lignin)是一種廣泛存在于植物體中的、無定形的、分子結構中含有氧代苯丙醇或其衍生物結構單元的芳香性高聚物，是由松柏醇、香豆素、芥子醇3種醇單體通過羥基或甲氧基取代的苯丙烷單體經無序聚合而成的三維復雜結構[1]。木質素主要填充于纖維素構架中，以增強植物體的機械強度，避免生物侵害和水的侵蝕，具有抗菌、抗氧化、抗吸收紫外線和阻燃等功能，同時具有較高的穩定性，因而自然降解速率緩慢。在木本植物中，木質素含量僅次于纖維素，是世界上第2位最豐富的有機物。

我國是秸稈資源最豐富的國家之一。據報道，我國農作物秸稈年產量為6億～7億t，約占世界總產量的1/3。木質纖維素是農作物秸稈的主要成分，也是地球上數量最大的可再生能源物質。植物體內木質素將纖維素緊緊包圍，一般的微生物很難進入，因此很難分解纖維素，進而導致秸稈資源開發利用困難[2]。數據表明，造紙工業每年要從植物中分離出約1.4億t纖維素，同時得到5 000萬t左右的木質素副產品，但超過95%的木質素以“黑液”直接排入江河或濃縮直接燒掉，不符合建設節約型經濟體系的思路。木質素的科學利用決定木質素經濟效益的可持續發展。現今，環境污染和資源匱乏等問題不斷深化，天然高分子所具有的可再生、可降解等性質也日益受到重視。因此，木質素的高效降解成為國內外的研究熱點。

國內外已有的降解方法包括物理降解、化學降解、物理-化學降解、物理-生物降解、物理-化學-生物降解以及生物降解[3]。其中，生物降解法使用最多且效果最明顯。降解木質素的微生物主要是真菌、細菌和放線菌，其中真菌占主導作用[4-5]。木質素降解酶的研究主要集中在白腐菌酶系，最為重要的酶有3種，即木質素過氧化物酶(lignin peroxidases，Lip)、錳依賴過氧化物酶(manganese perxidases，Mnp)和漆酶(laccase)[6]。目前，白腐真菌是唯一已知的在純培養條件下可將木質素徹底分解的微生物，它能分泌胞外氧化酶來降解木質素，其降解木質素的能力優于分解纖維素的能力，被認為是迄今最有價值的木質素降解微生物。其類屬中的蟲擬蠟菌(Ceriporiopsissubvermispora)[7]、產芽孢木質素降解菌MN-8[8]、高溫木質素降解菌(GeobacilluscaldoxylosilyticusJ16)[9]和綠色木霉Bax[10]等菌對木質素的降解具有較強的選擇性。國內外已有許多關于白腐菌篩選及其降解木質素的研究，但因篩選方法具有局限性，造成優良菌株漏篩甚至錯篩，不利于尋找新的木質素高效降解菌株[10]。且在研究過程中大多數白腐菌在降解木質素時選擇性較差，所以分離篩選優良木質素降解菌及其優化發酵條件提高酶活性具有重要的現實意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 校園周邊竹林地表土壤、地表下5 cm土壤及長有子實體的腐木。

1.1.2 培養基 初篩培養基：K2HPO40.5 g、KH2PO40.5 g、NaCl 0.2 g、NH4NO31.0 g、MgSO40.2 g、CaCl20.2 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、MnSO4·H2O微量、竹粉10 g(鮮竹磨粉，過40目篩，65 ℃烘16 h)、瓊脂粉20 g，加蒸餾水定溶至1 L，121 ℃ 高壓滅菌20 min，倒平板，備用。

復篩培養基1：馬鈴薯200 g、酵母粉15～20 g、蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、氯化鈉5 g、愈創木酚0.2 mL，蒸餾水定容到 1 L，pH值為7.0，瓊脂粉20 g，121 ℃高壓滅菌20 min，倒平板，備用。

復篩培養基2：馬鈴薯200 g、酵母粉15～20 g、蛋白胨 5 g、葡萄糖10 g、氯化鈉5 g、苯胺蘭0.1 g，蒸餾水定容到1 L，pH值為7.0，瓊脂粉20 g，121 ℃高壓滅菌20 min，倒平板，備用。

產酶發酵培養基：K2HPO42 g、(NH4)2SO42 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、木質素10 g，pH值6.0，蒸餾水定容到1 L。

1.2 試驗方法

1.2.1 初篩 將采集的樣品各稱取1 g于10 mL生理鹽水中洗滌，取洗滌液，共得到5種待用樣品。將上述1～5菌液分別進行梯度稀釋10-3～10-6并涂布于初篩培養基上，每個平板涂布100 μL。將上述得到的菌落挑于復合營養初篩培養基中，30 ℃恒溫培養箱培養，逐次分離直到得到單菌落，將分離純化出的菌株保存、備用。

1.2.2 復篩 將初篩得到的單菌落，用滅過菌的牙簽挑取，并分別接種于上述復篩培養基1平板中和復篩培養基2平板中，根據培養基產生的現象篩選出菌株。

1.2.3 酶活性的測定

1.2.3.1 木質素過氧化物酶活性測定 選用藜蘆醇作為底物，反應體系如下：125 mmol/L酒石酸鈉緩沖液(pH值為3.0)3.2 mL，10 mmol/L藜蘆醇0.1 mL，酶液0.6 mL，加入 10 mmol/L H2O2溶液0.1 mL啟動反應，測反應最初3 min內310 nm處D值的變化。以煮沸滅活15 min酶液反應混合液作對照。酶活性定義為1 min使得反應液吸光值變化0.1的酶量為1個酶活性單位(U)[11]。

1.2.3.2 錳過氧化物酶活性測定 50 mmol/L乳酸鈉緩沖液(pH值為4.5)3.4 mL，1.6 mmol/L MnSO4溶液 0.1 mL，0.4 mL的培養基濾出液，預熱至32 ℃加入 1.6 mmol/L H2O2溶液0.1 mL啟動反應，測反應最初 3 min 內240 nm處吸光度變化。酶活性定義為1 min內1 mL培養基濾液增加0.1個D值為1個酶活性單位[12]。

1.2.3.3 漆酶的酶活測定 取1.5 mL濃度為50 mmol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH值為4.5)，1 mL濃度為 0.4 mmol/L 的愈創木酚和1 mL粗酶液，放在25 mL試管中振蕩混勻，預熱至32 ℃反應5 min，反應結束100 ℃煮沸滅活5 min，立即冷卻，然后加蒸餾水至20 mL，混勻，測定470 nm下10 min內ΔD，470 nm消光系數ε=49 600 mol/(L·cm)。酶活性定義1 L反應液1 min使ΔD470 nm值改變0.1為1 U[13]。

1.2.4 菌株鑒定

1.2.4.1 形態觀察 菌株在高氏一號培固體養基上28 ℃培養36 h后進行菌落形態觀察，放于4 ℃冰箱中保存。挑取單一菌落進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察其菌體形態結構。

1.2.4.2 生理生化鑒定 參照文獻[14]中的方法對菌株BP01進行生理生化試驗檢測。依據《常見細菌系統鑒定手冊》，對分離到的菌株BP01進行初步鑒定[15]。

1.2.4.3 基因組提取和16S rRNA基因擴增 參考Rainey等的方法[16]提取細菌總DNA，略有修改，用1.0%瓊脂糖電泳檢測。

PCR反應體系：16.25 μL、ddH2O、2.5 μL 10×PCR buffer、2 μL dNTPs(各2.5 mmol/L)、1.0 μL F27正向引物(5′-AG AGTTTGATCCTGGCTCAG- 3′)(10 μmol/L)、1.0 μL R1492反向引物(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)(10 μmol/L)、2 μL模板、0.25 μLTaqDNA聚合酶(5 μg/μL)，反應總體積為20 μL。擴增循環體系：94 ℃預變性4 min；94 ℃ 變性40 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸80 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物經電泳檢測后，其產物回收純化后與pMD-19T載體連接，轉入感受態細胞DH5α，篩選陽性重組子，郵寄至上海英俊生物技術公司測序，核酸序列用于構建系統發育樹。

1.2.4.4 16S rRNA序列分析與構建系統發育樹 通過測序獲得的16S rRNA序列用NCBI中BLAST搜索與GenBank數據庫進行相似性分析，從而獲得相應菌株16S rRNA序列，在Clustal X(1.8)程序包中進行多重序列比對排列分析。利用MEGA 6.0軟件中的Neighbor-Joining法構建系統發育樹[17]。

1.2.5 菌株產酶條件的優化

1.2.5.1 時間 將待優化菌種接入液體產酶培養基中，接種量為5%。置于32 ℃、160 r/min搖床上進行培養，觀察并記錄其生長狀況，待菌液培養至其菌絲一定量時，開始測定木質素降解酶系中的Lip活性，并每過12 h測定記錄1次，測定 5～7 d。作出Lip活性隨培養時間變化的變化曲線，找出Lip最佳產酶活時間，并綜合確定優化的最佳培養時間。

1.2.5.2 碳源及濃度 分別以葡萄糖、麥麩、蔗糖、馬鈴薯浸出液、可溶性淀粉和玉米粉作為液體產酶培養基中的唯一碳源，碳源的質量濃度為20 mg/mL，于32 ℃、160 r/min下搖床培養上述已經確定的最佳培養時間，后進行Lip活性的測定，綜合比較選擇酶活性較大的碳源。將已經選出的最佳碳源分別設置濃度為5、10、15、20、30、40 mg/mL，于上述條件下進行搖床培養，測定最佳培養時間的Lip活性，綜合比較選出最佳碳源的最適酶活性濃度。

1.2.5.3 氮源及濃度 分別以牛肉膏、蛋白胨、硫酸銨、硝酸銨、酵母粉和尿素作為液體產酶培養基中的唯一氮源，氮源的質量濃度為1 g/L，于32 ℃、160 r/min下搖床培養上述已經確定的最佳培養時間，后進行Lip活性的測定。其中培養基碳源選擇筆者已經確定的最佳碳源及其濃度，綜合比較選擇酶活性較大的氮源。將已經選出的最佳氮源分別設置濃度為0.5、1、2、4、6、8 g/L，于上述條件下進行搖床培養，測定最佳培養時間的Lip酶活性，綜合比較選出最佳氮源的最適酶活性濃度。

1.2.5.4 不同pH值對產酶條件的影響 分別設定pH值為5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5，將菌株于160 r/min的搖床上進行培養。碳源、氮源分別選擇已優化出的最佳碳源、氮源及其相應的濃度，于確定的最佳培養時間進行Lip活性的測定，綜合比較選擇酶活性最高時的pH值。

1.2.5.5 溫度 分別設定溫度為20、25、32、37、40、45 ℃，將菌株于160 r/min的搖床上進行培養。碳源、氮源和pH值分別選擇已優化的最佳碳源、氮源及其相應的濃度和pH值，于確定的最佳培養時間進行Lip活性的測定，綜合比較選擇酶活性最高時的溫度。

1.2.5.6 不同裝液量對產酶條件的影響 于250 mL的三角瓶中分別裝液30、50、80、100、120 mL液體產酶培養基，置于最佳溫度160 r/min下進行搖床培養。其中，碳源、氮源、溫度、pH值分別選擇已優化的最佳碳源、氮源、溫度和pH值，并于確定的最佳培養時間進行Lip活性的測定，綜合比較選擇酶活性最高時的裝液量。

1.2.5.7 綜合最佳條件進行培養測定 在確定的最佳碳源和氮源及其最佳濃度、溫度、pH值、裝液量下，將菌恒溫 160 r/min 下搖床培養相應時間后測定Lip活性，與上各單因素測定酶活性比較在綜合條件下其酶活性是否有大的改進，從而可以了解菌產酶條件的優化情況。

2 結果與分析

2.1 篩選結果

2.1.1 初篩 通過平板稀釋法初步篩選出有木質素降解作用的菌株18株進行復篩，其中苯胺藍脫色圈直徑≥ 30 mm 的2株，脫色圈直徑在20～30 mm的3株，其余13株菌脫色圈相對較小，可能降解作用較低，其中BP01的降解能力最強，其脫色圈直徑為35.0 mm，且愈創木酚苯胺藍脫色圈直徑也達到了20 mm(表1)。因此，選BP01進行形態觀察、生理生化試驗與16S rDNA的序列測定來確定該菌株的分類地位。

2.1.2 復篩 通過對初篩得到的18株菌進行木質素過氧化物酶活性測定，其中菌株BP01木質素過氧化物酶與錳過氧化物酶活性為266.33、58.12 U/L，為18株菌中最高的；漆酶活性相對較低(表2)。因此，隨后的木質素的降解條件優化以木質素過氧化物酶作為指標。

表1 木質素降解菌初篩結果

表2 18株菌木質素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶活性

2.2 鑒定結果

2.2.1 形態觀察 菌株在含有木質素的營養瓊脂固體平板上生長，出現了透明圈，無可溶性色素。有臭味，乳白色，濕潤，菌落大而扁平，邊緣不整齊呈鋸齒狀，表面粗糙，半透明，正反面顏色相同，生長快，易挑起，不產生色素。通過形態觀察，初步判定為細菌。經革蘭氏染色后發現，細胞呈桿狀，革蘭氏染色為紫色，呈陽性。

2.2.2 生理生化反應 該菌株能分解葡萄糖，產酸但不產氣，V.P試驗為陽性反應，甲基紅試驗為陰性，吲哚試驗陽性反應，有吲哚生成，淀粉水解呈陽性，過氧化氫酶檢測呈陽性，有氣泡生成，不能利用明膠，硝酸鹽還原試驗呈陽性，不產硫化氫。根據BP01菌株的形態特征和生理生化特征鑒定的結果，對照《伯杰氏細菌鑒定手冊》，初步得出菌株BP01與類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)細菌很相近。

2.2.3 菌株BP01序列測定 測序后得到菌株BP01序列長度為1 516 bp，其序列如下：

A C G G T T A C C T T G T T A C G A C T T C A C C C C A A T C A T C T A C C C C A C C T T C G A C G G C T G G C T C C T T G C G G T T A C C C C A C C G G C T T C G G G T G T T G T A A A C T C T C G T G G T G T G A C G G G C G G T G T G T A C A A G A C C C G G G A A C G T A T T C A C C G C G G C A T G C T G A T C C G C G A T T A C T A G C A A T T C C G A C T T C A T G C A G G C G A G T T G C A G C C T G C A A T C C G A A C T G A G A C C G A C T T T G T T G G G A T T G G C T C C A C C T C G C G G T T T C G C G A C C C G T T G T A T C G G C C A T T G T A G T A C G T G T G T A G C C C A G G T C A T A A G G G G C A T G A T G A T T T G A C G T C A T C C C C A C C T T C C T C C G G T T T G T C A C C G G C A G T C A T C C T A G A G T G C C C A C C C A A A G T G C T G G C A A C T A A G A T C A A G G G T T G C G C T C G T T G C G G G A C T T A A C C C A A C A T C T C A C G A C A C G A G C T G A C G A C A A C C A T G C A C C A C C T G T C T C C T C T G T C C C G A A G G A A A G T C C T A T C T C T A G G A C G G T C A G A G G G A T G T C A A G A C C T G G T A A G G T T C T T C G C G T T G C T T C G A A T T A A A C C A C A T A C T C C A C T G C T T G T G C G G G T C C C C G T C A A T T C C T T T G A G T T T C A G T C T T G C G A C C G T A C T C C C C A G G C G G A A T G C T T A A T G T G T T A A C T T C G G C A C C A A G G G T A T C G A A A C C C C T A A C A C C T A G C A T T C A T C G T T T A C G G C G T G G A C T A C C A G G G T A T C T A A T C C T G T T T G C T C C C C A C G C T T T C G C G C C T C A G C G T C A G T T A C A G C C C A G A A A G T C G C C T T C G C C A C T G G T G T T C C T C C A C A T C T C T A C G C A T T T C A C C G C T A C A C G T G G A A T T C C A C T T T C C T C T T C T G T A C T C A A G C T T T G C A G T T T C C A T T G C G A C T C G A A G T T G A G C T C C G A G T T T A A A C A A C A G A C T T A C A A G G C C G C C T G C G C G C G C T T T A C G C C C A A T A A T T C C G G A C A A C G C T T G C C C C C T A C G T A T T A C C G C G G C T G C T G G C A C G T A G T T A G C C G G G G C T T T C T T C T C A G G T A C C G T C A C C T A T G G A G C A G T T A C T C T C C A T A G C G T T C T T C C C T G G C A A C A G A G C T T T A C G A T C C G A A A A C C T T C A T C A C T C A C G C G G C G T T G C T C C G T C A G A C T T T C G T C C A T T G C G G A A G A T T C C C T A C T G C T G C C T C C C G T A G G A G T C T G G G C C G T G T C T C A G T C C C A G T G T G G C C G A T C A C C C T C T C A G G T C G G C T A T G C A T C G T C G C C T T G G T G A G C C G T T A C C C C A C C A A C T A G C T A A T G C A C C G C A G G T C C A T C C A T A A G T G G C A G A T T G C T C C G C C T T T C C C A A C T C G G C C A T G C G A C C A A A T T G C G T A T C C G G T A T T A G C A T C C G T T T C C G A A T G T T A T C C C A G T C T T A T G G G C A G G T T A C C C A C G T G T T A C T C A C C C G T C C G C C G C T A A C C A C G C G T T T C C C G A A G G A A A C G C T A G G T C C G C T C G A C T T G C A T G T A T T A G G C A C G C C G C C A G C G T T C G T C C T G A G C C A T G A T C A A A C T C T

2.2.4 16S rDNA系統發育樹的構建 測序獲得的菌株BP01的16S rDNA序列，將測得的序列與數據庫中已注冊的16S rDNA序列用BLAST搜索進行序列相似性比較分析。將Genbank中與菌株BP01相似性較高的12個菌株進行系統發育樹的構建(圖1)，供試菌株的16S rDNA序列與芽孢桿菌屬的標準菌株同源相似度大部分在97%以上。通常當2個細菌的16S rDNA的相似性大于95%時，可將其歸為同一屬[18]，而同源性大于96%的序列均來自類芽孢桿菌屬，初步將此菌株歸為類芽孢桿菌屬。同時BP01在系統發育樹上與類芽孢桿菌(Paenibacillusxinjiangensisstrain B538)B538(登錄號為NR_043221)聚集在同一個分支中，且16S rDNA序列的同源相似性最為99%。結合其形態特征及生理生化特性與類芽孢桿菌屬較為一致，因此菌株BP01為類芽孢桿菌屬，命名為Paenibacillussp. BP01。

2.3 產酶優化結果

2.3.1 BP01培養時間 將BP01接入產酶發酵培養基中(接種量為2%)，置于32 ℃、160 r/min搖床上進行培養，觀察并記錄其生長狀況，每12 h測定記錄1次，共5 d。結果發現，BP01的酶活性在0～72 h逐漸增大，在72 h時達到最大，當培養時間超過72 h其酶活性隨著時間的增大而減小(圖2)。因此，確定培養時間確定為72 h。

2.3.2 BP01最佳碳源的確定 以葡萄糖、麥麩、蔗糖、馬鈴薯浸出液、可溶性淀粉(質量濃度為2 g/100 mL)作為唯一碳源，將BP01接種后的三角瓶于32 ℃、160 r/min搖床上培養2 d，對酶活性進行測定。結果發現，BP01是在葡萄糖作為唯一碳源條件下培養，具有最大的酶活性(4.21 U/mL，圖3)。因此，葡萄糖為BP01產酶最佳碳源。

將最佳碳源葡萄糖分別設置濃度為10、15、20、30、40 mg/mL 于上述條件下進行搖床培養，測定培養2 d后的Lip活性。結果發現，當葡萄糖的濃度為15 mg/mL時，其酶活性達到最大，為4.49 U/mL(圖4)。因此，選擇15 mg/mL作為最佳碳源葡萄糖的最適濃度。

2.3.3 BP01最佳氮源的選擇 以牛肉膏、蛋白胨、硫酸銨、硝酸銨、酵母粉、尿素作為產酶發酵培養基中的唯一氮源，氮源的質量濃度為1 g/L；碳源選擇15 g/L葡萄糖將接種 BP01 的三角燒瓶于32 ℃、160 r/min下搖床培養2 d，對Lip活性進行測定。結果發現，BP01在酵母粉為氮源的條件下培養，酶活性最大時為4.32 U/mL(圖5)。因此，將酵母粉作為產酶培養的最佳氮源。

將最佳氮源酵母粉分別設置濃度為 0.5、1、2、4、6、8 mg/mL，于上述條件下進行搖床培養2 d，測定Lip的活性。結果發現，當酵母粉濃度為6 mg/mL時，其酶活性最大為5.48 U/mL(圖6)。因此選擇6 mg/mL作為最佳氮源酵母粉的最佳濃度。

2.3.4 BP01 pH值的選擇 將產酶發酵培養基的pH值分別調至5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5，加入15 g/L葡萄糖、6 g/L酵母粉，將BP01接種后的三角瓶于32 ℃、160 r/min下搖床培養 2 d，培養基相應成分及濃度使用前面已經優化出來的結果，測定Lip活性。結果發現，當pH值=7時BP01的酶活性最大，為4.93 U/mL(圖7)。因此，選擇pH值=7作為產酶最佳的pH值，過酸過堿對產酶都有一定的影響。

2.3.5 BP01溫度的選擇 將恒溫搖床的溫度分別設置為28、32、37、40、45 ℃，加入15 g/L葡萄糖、6 g/L酵母粉，培養基的pH值調至為7，將BP01接種后的三角瓶于160 r/min下搖床培養 2 d，測定Lip活性。結果發現，當溫度為37 ℃時，其酶活性最大，為5.57 U/mL(圖8)。因此，選擇37 ℃作為最佳的產酶溫度。

2.3.6 BP01裝液量選擇 于250 mL的三角瓶中分別裝40、60、80、120 mL液體產酶培養基，加入15 g/L葡萄糖、6 g/L酵母粉，pH值調至7，將BP01接種后的三角瓶置于37 ℃、160 r/min 下進行搖床培養2 d，測定Lip活性。結果發現，當裝液量為100 mL時，其酶活性最大(圖9)。因此，選擇 100 mL 作為產酶的最佳裝液量。

2.3.7 BP01綜合最佳條件培養 綜合前面的優化結果，即在15 g/L葡萄糖、6 g/L酵母粉、pH值=7、37 ℃和裝液量為 100 mL 的條件下，將接種BP01后的三角瓶置于160 r/min搖床上進行搖床培養3 d，取部分6 000 r/min離心10 min得到取上清液為粗酶液。測定Mnp活性達到了6.47 U/mL，對于所測的這個酶活性雖然不是在整個試驗過程中酶活性最高的數據，但是對于試驗之初還是較大的提高，起到了一定的優化作用。

3 結論

從腐木上的子實體篩選出菌株能選擇性降解木質素的菌株BP01，通過生理生化鑒定試驗及16S rDNA序列分析對菌株進行鑒定試驗確定菌株BP01為類芽孢桿菌屬。在 BP01 產酶特性研究中，對其產酶條件進行研究及條件優化，經測定，菌株BP01在碳源(葡萄糖)15 g/L、氮源(酵母粉)6 g/L、溫度為37 ℃、pH值=7.0、裝液量100 mL的條件下培養 72 h，其產過氧化物酶(Lip)活性達到最高，為6.47 U/mL。這將為深入研究木質素的生物降解及其開發利用提供試驗依據。

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