Sestrin2在吸煙誘導的肺泡Ⅱ型上皮細胞損傷中的作用機制

姜曉亮，劉 雪，劉云鵬，付 慧，劉 星，楊志偉(中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，北京協和醫學院比較醫學中心，北京 100021)

吸煙是嚴重危害公共健康的重大問題，也是導致支氣管肺癌和慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)等疾病發展的重要病因之一[1]。香煙煙霧(cigarette smoke，CS)含有多種復雜的化學物質，包括大量的自由基以及高濃度的氧化劑[2]。香煙煙霧中自由基的吸入可導致氧化應激反應，直接損傷肺泡上皮細胞，是誘發肺損傷的第一步[3]。肺泡II型上皮細胞(alveolar type II epithelial cells，AT-II)是肺泡上皮的干細胞[4]，它的損傷參與了多種慢性氣道疾病的發展，導致不良預后的發生[5 - 6]。因此，保護AT-II細胞免受香煙煙霧的傷害，在多種與吸煙相關肺病的治療中有重要意義。

Sestrin2是抗氧化蛋白Sestrin家族的重要成員[7]，它可緩解糖尿病代謝異常、心血管疾病等導致的氧化應激損傷[8 - 9]，近年來被認為是一種高效的安全生物制劑。Sestrin2通過抑制過氧化物酶(Prx-SO2/3H)的超氧化，降低細胞內活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平[10]，從而發揮抗氧化作用，可能參與吸煙誘導的AT-II細胞損傷的發生發展，然而肺泡上皮細胞受到煙霧刺激損傷時Sestrin2的作用機制仍然不是很清楚。因此，該研究以肺泡II型上皮細胞為靶細胞，從而對Sestrin2在香煙煙霧誘導的AT-II細胞損傷中的作用機制進行初步探討。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

人A549細胞株(肺泡Ⅱ型上皮細胞來源)購自美國培養物保存中心(ATCC，編號：CRM-CCL-185)。

1.2 主要試劑與儀器

1640培養基購于Gibco公司；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和雙抗以及Lipofectamine TM2000購自Invitrogen公司；Sestrin2抗體、GAPDH抗體購自Cell Signaling Technology公司；peroxiredoxin-Cys和peroxiredoxin-SO3抗體購自Abcam公司；Sestrin2 siRNA和non-silencing siRNA購自Thermo Scientific公司；2’, 7’-二氯熒光素二乙酸酯(2’, 7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFDA)購自Molecular Probes公司；羰酰氰基對氯苯脘購自Sigma公司；山羊抗兔/鼠二抗購自北京中山金橋公司；TNF-α和IL-8檢測ELISA試劑盒購自上海信帆生物有限公司。電泳儀(北京六一儀器廠，DYY-C)；電泳槽(上海天能，VE-180)；電轉槽(上海天能，VE-186)；多功能酶標儀(Multiskan GO)；化學發光凝膠成像儀(Tanon-5500)；正向顯微鏡(Leica DM6000 B)；低溫高速離心機(Beckman)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養和實驗分組

將A549細胞用含10% FBS的1640培養基，置于37℃、5% CO2的培養箱中培養。取指數生長期細胞接種于相應的培養皿中長至約70%～80%，實驗前需換無血清的培養基培養2～4 h然后用于實驗。然后將A549細胞分為八組：對照組、香煙煙霧提取物(cigarette smoke extract，CSE)處理組(10%，24 h)、阿奇霉素(azithromycin，AZM)處理組(5 μg/mL，24 h)、CSE +阿奇霉素處理組、轉染non-silencing siRNA組(10 nmol/L，48 h)、轉染Sestrin2 siRNA組(10 nmol/L，48 h)、轉染non-silencing siRNA +阿奇霉素處理組和轉染Sestrin2 siRNA +阿奇霉素處理組。

1.3.2 香煙煙霧提取物(CSE)的制備

參照Carp等[11]的方法，將兩支香煙去掉濾嘴后燃燒，由50 mL注射器負壓吸引裝置(改造)連續勻速抽吸(50 mL/min)，該裝置將煙霧吸入10 mL的1640培養基中，香煙在15 min內需要燃燒完畢，然后充分搖動使其溶解制成懸液，并用1 mol/L氫氧化鈉(NaOH)將pH調至7.2～7.4，最后用0.22 μm孔徑的濾器(Millipore，Watford，UK)過濾，除去細菌和雜質。制備好的CSE原液用不含血清的1640培養基稀釋10倍[12]，濃度用百分數表示(10%)，在30 min內用于實驗。

1.3.3 A549細胞Sestrin2基因沉默

A549細胞在6孔培養皿中培養24 h，細胞密度達到每孔2 × 105個。按照說明書的步驟，使用Lipofectamine TM2000將Sestrin2 siRNA(10 nmol/L)轉入到A549細胞中，non-silencing siRNA作為陰性對照。轉染48 h后更換新鮮的培養基(含10% FBS)，用免疫印跡法檢測細胞中Sestrin2的表達。

注：與對照組相比，# P< 0.05；與未進行阿奇霉素處理的香煙煙霧提取物組相比，* P< 0.05。圖1 香煙煙霧提取物對肺泡上皮細胞ROS和細胞因子的影響Note.Compared with the control group,#P< 0.05. Compared with the CSE group without AZM treatment, *P< 0.05.Fig.1 Effects of cigarette smoke extract on ROS production and the secretion of cytokines in the pulmonary alveolar epithelial A549 cells

1.3.4 Western blot檢測蛋白表達

用細胞刮收集各組處理后的細胞，放置到蛋白裂解液中制備總蛋白樣本，BCA法測蛋白濃度并調整一致。每個樣本取30 μg上樣進行SDS-PAGE電泳，轉膜，脫脂奶粉常溫封閉1 h，抗體稀釋液將不同抗體按比例稀釋：抗Sestrin2(1∶500)、peroxiredoxin-Cys(1∶1000)、peroxiredoxin-SO3(1∶200)和GAPDH一抗，放置于4℃冰箱孵育過夜，再次洗膜，室溫下孵育二抗(1∶5000，1 h)，洗膜后使用化學發光試劑顯色，NC膜掃描保存并定量分析。

1.3.5 炎癥因子水平檢測

取實驗各組細胞上清液，ELISA方法檢測細胞上清液TNF-α和IL-8的水平，所有實驗操作均嚴格按照ELISA試劑盒使用說明書進行，并設定實驗平行組，最終使用酶標儀讀數并分析。

1.3.6 細胞內ROS水平檢測

細胞內ROS水平采用DCFDA熒光探針進行檢測。藥物處理的細胞使用無血清的1640培養基洗1次后，加入10 μmol/L DCFDA于37℃孵育30 min，羰酰氰基對氯苯脘作陽性對照。使用微板閱讀器在485 nm的激發波長和530 nm的發射波長上測量DCFDA熒光并計算ROS的陽性率。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 香煙煙霧提取物誘導肺泡上皮細胞發生氧化應激

已有研究證實氧化應激是香煙煙霧的主要致病因子[12]，本研究采用香煙煙霧提取物(CSE，10%)處理肺泡上皮細胞24 h。研究發現CSE組細胞ROS產量較對照組顯著升高(P< 0.05，圖1A)，細胞分泌的TNF-α和IL-8顯著增多(P< 0.05，圖1B和1C)。研究證實在A549細胞中，阿奇霉素能夠抑制CSE誘導的氧化應激損傷[13]，因此本研究在CSE處理的基礎上同時給予阿奇霉素(AZM，5 μg/mL)。如圖1所示，AZM能夠顯著緩解CSE誘導的ROS產生，細胞分泌的TNF-α和IL-8等炎癥因子較未進行阿奇霉素處理的CSE組亦顯著減少。

2.2 Sestrin2在肺泡上皮細胞氧化應激中的作用

圖2A顯示，CSE處理A549細胞后抗氧化蛋白Sestrin2的表達較對照組顯著降低[(71±7.2)%比(100±8.7)%，P< 0.05]，該結果顯示Sestrin2可能通過其抗氧化作用參與了吸煙誘導的COPD。為證實Sestrin2在COPD中的重要作用，本研究給予肺泡上皮細胞Sestrin2 siRNA(10 nmol/L)處理。48 h后檢測Sestrin2蛋白表達顯著降低[(50±8.9)%比(100±10)%，圖2B]。Sestrin2 siRNA沉默組細胞的ROS的產量較對照組顯著升高(P< 0.05，圖3 A)，炎癥因子TNF-α和IL-8的水平顯著增加(P< 0.05，圖3B和3C)。但給予Sestrin2 siRNA組阿奇霉素，發現升高的ROS并沒有顯著降低，Sestrin2 siRNA沉默后使得阿奇霉素的抗氧化作用效果減弱。該結果證實了Sestrin2在肺泡上皮細胞中重要的抗氧化作用，同時顯示阿奇霉素能夠直接或者間接通過Sestrin2發揮其抗氧化功能。

2.3 Sestrin2通過抑制Prx-SO2/3的超氧化參與肺泡上皮細胞氧化應激的機制

Sestrin2能夠抑制過氧化物酶的超氧化從而抑制ROS的產生[10]。過氧化物酶是一種以硫為基礎的抗氧化酶，它通過兩對半胱氨酸的氧化(Prx-SO2/3)，導致過氧化物酶活性的失活[14]。為探索肺泡上皮細胞中Sestrin2對過氧化物酶的調節作用，本研究檢測了peroxiredoxin-SO3(Prx-SO2/3)和總peroxiredoxin-Cys(Prx-2Cys)蛋白的表達，計算二者的比率。如圖4 A所示，CSE處理A549細胞后Prx-SO2/3表達較對照組顯著增加[(232±8.1)%比(100±4.6)%，P< 0.05]而總Prx-2Cys不變，加入AZM能夠顯著減少CSE誘導的Prx-SO2/3超氧化[(171±13)%比(232±8.1)%，P< 0.05]。Sestrin2 siRNA同樣能夠誘導Prx-SO2/3超氧化[(156±9.1)%比(100±5.1)%，P< 0.05]，但Sestrin2 siRNA沉默后再給予AZM并不能減少Prx-SO2/3的超氧化[(148±7.9)%比(156±9.1)%，圖4B]。證實A549細胞中Sestrin2通過抑制Prx-SO2/3的超氧化，從而抑制過氧化物酶的失活以及ROS產生，可能成為COPD抗氧化治療的重要機制。

注：與對照組相比，# P< 0.05；與未進行阿奇霉素處理的香煙煙霧提取物組相比，* P< 0.05；與未沉默組相比，& P< 0.05。圖2 Sestrin2在肺泡上皮細胞中的表達Note.Compared with the control group,#P< 0.05. Compared with the CSE group without AZM treatment, *P< 0.05. Compared with the non-silencing siRNA group, &P< 0.05.Fig.2 Expression of Sestrin2 in the pulmonary alveolar epithelial A549 cells

注：與未沉默組相比，& P< 0.05。圖3 Sestrin2 siRNA對肺泡上皮細胞ROS和細胞因子的影響Note.Compared with the non-silencing siRNA group, &P< 0.05.Fig.3 Effects of Sestrin2 siRNA on ROS production and secretion of cytokines in the pulmonary alveolar epithelial A549 cells

注：與對照組相比，# P< 0.05；與未進行阿奇霉素處理的香煙煙霧提取物組相比，* P< 0.05；與未進行阿奇霉素處理的未沉默組相比，& P< 0.05。圖4 Prx-SO2/3和Prx-Cys在肺泡上皮細胞中的表達Note.Compared with the control group,#P< 0.05. Compare with the CSE group without AZM treatment, *P< 0.05. Compared with the non-silencing siRNA group without AZM treatment,&P< 0.05.Fig.4 Expression of Prx-SO2/3 and Prx-Cys in the pulmonary alveolar epithelial A549 cells

3 討論

吸煙是導致肺內呼吸障礙的主要病因，包括慢性阻塞性肺疾病和特發性肺纖維化[15]，其特征是肺泡上皮細胞的不可逆損傷。香煙煙霧(CS)是活性氧的豐富來源，氧化應激損傷是香煙煙霧的主要致病因子[12]。香煙煙霧的化學成分復雜，在本研究中，香煙煙霧提取物(CSE)被用于模擬香煙煙霧。在肺的各種細胞類型中，肺泡上皮細胞是氧化損傷的主要部位之一。與I型肺泡細胞(ATI)相比，肺泡Ⅱ型上皮細胞(ATII)在肺內的免疫反應中發揮著重要作用，它可以分泌多種細胞因子和趨化因子對呼吸刺激引起的慢性阻塞性肺疾病等慢性肺病的發展起重要作用[16]。本實驗選用的人A549細胞系來源于肺泡Ⅱ型上皮細胞，其脂質轉運體和補體系統與原代培養的ATII細胞具有顯著相似性，作為ATII細胞生理模型廣泛應用[17]。通過給予A549細胞香煙煙霧提取物(CSE)干預，本研究發現抗氧化蛋白Sestrin2能夠抑制過氧化物酶Prx-SO2/3超氧化，從而阻斷肺泡細胞內活性氧(ROS)的過度生成并抑制炎癥因子分泌增多，可能成為吸煙誘導肺泡II型上皮細胞損傷及吸煙相關肺病治療的新靶點。

Sestrins蛋白是一類保守的應激誘導型抗氧化蛋白，在氧化應激和DNA損傷時表達上調[9]。哺乳動物的Sestrins家族成員主要包括：Sestrin1、Sestrin2和Sestrin3。Sestrin2是Sestrins家族中的重要成員，它是p53的轉錄調控底物分子[18]。Sestrin2能通過抑制細胞內ROS生成而發揮抗氧化作用，對抗糖尿病代謝異常、心血管疾病等導致的氧化應激損傷，近年來被廣泛研究[8 - 9]。本研究證明在A549細胞中CSE可誘導Sestrin2表達抑制和ROS的大量生成，而同時給予阿奇霉素能夠有效緩解ROS的增多，并且使得Sestrin2表達增加。Barnes[19]在2013年提出了香煙煙霧通過氧化應激誘導慢性阻塞性肺疾病的過程。文章指出ROS通過激活NF-κB和p38 MAPK，從而導致促炎、炎性細胞因子和趨化因子基因的激活，進而加速肺損傷和慢性阻塞性肺疾病的發展[20]。TNF-α、IL-8是參與慢性氣道性疾病炎癥反應的重要促炎因子[21]，通過誘發氣道、肺實質以及肺部血管的慢性炎癥反應最終導致肺結構的破壞。因此本研究也檢測了Sestrin2對于炎癥因子TNF-α和IL-8水平的影響。發現給予A549細胞Sestrin2 siRNA之后ROS的生成增多，TNF-α和IL-8的水平顯著升高，但同時給予阿奇霉素無法降低ROS的生成，也不能緩解TNF-α和IL-8的升高，證實了抗氧化蛋白Sestrin2在肺泡II型上皮細胞氧化應激損傷以及炎癥反應中的重要作用。

研究表明Sestrin2可抑制過氧化物酶(Prx-SO2/3)的超氧化，清除細胞內的H2O2從而維持細胞內的氧化還原穩態[22]。為探索Sestrin2的作用機制，本研究用Sestrin2 siRNA沉默處理A549細胞，發現Sestrin2 siRNA組細胞中超氧化的Prx-SO2/3增多而總蛋白Prx-2Cys表達不變。Yang等[10]發現在腎臟中Sestrin2能夠抑制過氧化物酶(Prx-SO2/3)的超氧化，并且激活PON2信號通路參與了多巴胺D2受體誘導的ROS生成的阻斷。Woo等[23]也指出抑制Prx-2Cys的超氧化和Sestrin2對氧化應激的調節作用相似。本研究則證實在肺泡上皮細胞中Sestrin2通過抑制下游Prx-SO2/3的超氧化從而參與ROS的生成以及減少氧化應激。另外本研究額外給予Sestrin2 siRNA組的細胞阿奇霉素處理，發現氧化應激損傷并不能夠緩解。該結果再次證實了Sestrin2以及下游過氧化物酶在肺泡上皮細胞中的重要作用。Sestrin2也可通過多種機制參與ROS生成的調控，它通過下游信號通路在多種病理生理現象中發揮重要作用。研究發現Sestrin2能夠激活AMPK/mTORC1信號通路從而抑制ROS的生成并誘導細胞凋亡，被認為結腸直腸癌的新靶點[24]。在腎小球系膜細胞中Sestrin2能夠激活AMPK通路參與阻斷NOX4依賴的ROS生成[25]。另一項研究發現，選擇性降低Sestrin2的表達可激活下游mTORC1-S6K信號通路，從而導致胰島素抵抗、葡萄糖耐受不良并出現肥胖等一系列代謝病癥[26]。

綜上所述，Sestrin2能夠抑制過氧化物酶(Prx-SO2/3)的超氧化阻斷ROS的多度產生，在香煙煙霧誘導的肺泡II型上皮細胞損傷中起到重要的保護作用，可能為吸煙相關肺病的防治提供新思路。然而Sestrin2還能夠通過哪些信號途徑和相關機制來抑制香煙誘導的肺泡II型上皮細胞損傷目前尚不得知。此外是否有其他抗氧化或抗炎分子在這一過程中協同作用也不明確，還需要進一步探索研究。

參考文獻：

[1] Hartman TE, Tazelaar HD, Swensen SJ, et al. Cigarette smoking: CT and pathologic findings of associated pulmonary diseases [J]. RadioGraphics, 1997, 2(17): 377-390.

[2] Perfetti TA, Rodgman A. The complexity of tobacco and tobacco smoke [J]. Contrib Tob Res, 2011, 24(11): 215-232.

[3] Van Driessche W, Kreindler JL, Malik AB, et al. Interrelations/cross talk between transcellular transport function and paracellular tight junctional properties in lung epithelial and endothelial barriers [J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2007, 293(3): L520-L524.

[4] 朱召浩, 朱嘉羚, 戚薇巖, 等. 肺泡上皮細胞的研究進展 [J]. 藥物生物技術, 2017, 24(2): 159-162.

[5] 何志義, 冉丕鑫, 鐘南山. 氧化/抗氧化失衡與慢性阻塞性肺疾病 [J]. 國外醫學呼吸系統分冊, 2003, 23(1): 5-7.

[6] 張莉, 許建英. 香煙煙霧暴露對大鼠支氣管肺泡灌洗液及外周血4-HNE和γ-GCS表達的影響 [J]. 中國比較醫學雜志, 2012, 22(2): 43-46.

[7] Liu SY, Lee YJ, Lee TC. Association of platelet-derived growth factor receptor β accumulation with increased oxidative stress and cellular injury in sestrin 2 silenced human glioblastoma cells [J]. FEBS Lett, 2011, 585(12): 1853-1858.

[8] Morrison A, Chen L, Wang J, et al. Sestrin2 promotes LKB1-mediated AMPK activation in the ischemic heart [J]. FASEB J, 2015, 29(2): 408-417.

[9] 胡永亮, 譚啟杏, 王紅麗, 等. Sestrin2通過抑制砷化物誘導的氧化應激反應發揮拮抗細胞凋亡的保護性作用 [J]. 生物技術通訊, 2016, 27(3): 314-317.

[10] Yang Y, Cuevas S, Yang S, et al. Sestrin2 decreases renal oxidative stress, lowers blood pressure, and mediates dopamine D2 receptor-induced inhibition of reactive oxygen species production [J]. Hypertension, 2014, 64(4): 825-832.

[11] Carp H, Janoff A. Possible mechanisms of emphysema in smokers.Invitrosuppression of serum elastase-inhibitory capacity by fresh cigarette smoke and its prevention by antioxidants [J]. Am Rev Respir Dis, 1978, 118(3): 617-621.

[12] Faux SP, Tai T, Thorne D, et al. The role of oxidative stress in the biological responses of lung epithelial cells to cigarette smoke [J]. Biomarkers, 2009, 14(Suppl 1): 90-96.

[13] Chen M, Yang T, Meng X, et al. Azithromycin attenuates cigarette smoke extract-induced oxidative stress injury in human alveolar epithelial cells [J]. Mol Med Rep, 2015, 11(5): 3414-3422.

[14] Thamsen M, Kumsta C, Li F, et al. Is overoxidation of peroxiredoxin physiologically significant? [J]. Antioxid Redox Signal, 2011, 14(4): 725-730.

[15] Chen ZH, Kim HP, Sciurba FC, et al. Egr-1 regulates autophagy in cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease [J]. PLoS One, 2008, 3(10): e3316.

[16] Olivera D, Knall C, Boggs S, et al. Cytoskeletal modulation and tyrosine phosphorylation of tight junction proteins are associated with mainstream cigarette smoke-induced permeability of airway epithelium [J]. Exp Toxicol Pathol, 2010, 62(5): 133-143.

[17] Cooper JR, Abdullatif MB, Burnett EC, et al. Long term culture of the A549 cancer cell line promotes multilamellar body formation and differentiation towards an alveolar type II pneumocyte phenotype [J]. PLoS One, 2016, 11(10): e0164438.

[18] Deng W, Cha J, Yuan J, et al. p53 coordinates decidual sestrin 2/AMPK/mTORC1 signaling to govern parturition timing [J]. J Clin Invest, 2016, 126(8): 2941-2954.

[19] Barnes PJ. New anti-inflammatory targets for chronic obstructive pulmonary disease [J]. Nat Rev Drug Discov, 2013, 12(7): 543-559.

[20] 孫得勝, 歐陽瑤, 顧延會, 等. 慢阻肺大鼠肺組織中樹突狀細胞表面因子的表達變化及CCL20抗體的干預作用 [J]. 中國比較醫學雜志, 2016, 26(3): 11-15.

[21] 王立婧, 閆亮. 吸煙對COPD患者肺功能及IL-8和TNF-α的影響 [J]. 醫學綜述, 2014, 20(24): 4606-4607.

[22] Shin BY, Jin SH, Cho IJ, et al. Nrf2-ARE pathway regulates induction of Sestrin-2 expression [J]. Free Radic Biol Med, 2012, 53(4): 834-841.

[23] Woo HA, Bae SH, Park S, et al. Sestrin 2 is not a reductase for cysteine sulfinic acid of peroxiredoxins [J]. Antioxid Redox Signal, 2009, 11(4): 739-745.

[24] Wei JL, Fang M, Fu ZX, et al. Sestrin 2 suppresses cells proliferation through AMPK/mTORC1 pathway activation in colorectal cancer [J]. Oncotarget, 2017, 8(30): 49318-49328.

[25] Eid AA, Lee DY, Roman LJ, et al. Sestrin 2 and AMPK connect hyperglycemia to Nox4-dependent endothelial nitric oxide synthase uncoupling and matrix protein expression [J]. Mol Cell Biol, 2013, 33(17): 3439-3460.

[26] Lee JH, Budanov AV, Talukdar S, et al. Maintenance of metabolic homeostasis by Sestrin2 and Sestrin3 [J]. Cell Metab, 2012, 16(3): 311-321.