WNK1基因rs2301880位點多態性與血壓鈉反應性的家系關聯分析

，3

(1 西安交通大學醫院內科，陜西 西安 710049； 2 西安交通大學第一附屬醫院心內科； 3 陜西省人民醫院心血管內科)

高鹽攝入導致血壓升高，而血壓對鈉的反應性存在個體差異。本課題組前期的研究結果顯示,人群鹽敏感性的分布存在家庭聚集現象，新近研究顯示人群血壓對鈉鉀反應性具有明顯的遺傳傾向[1-7]。WNK激酶1(WNK1)是一種位于集合管遠端腎單位的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，又稱為無賴氨酸激酶1[8-11]。研究顯示WNK1基因多態性與高血壓的發生，以及高血壓病人尿鈉鉀的排泄有關[12-16]，但迄今為止尚未見WNK1基因多態性與血壓對高鹽干預反應性關系的研究報道。本研究以前期建立的以家系為基礎的鹽敏感性人群隊列作為研究對象，探討 WNK1基因rs2301880位點多態性與血壓對鈉干預反應性的關系，為今后探討鹽敏感性的形成機制以及鹽敏感性分子標志的篩選提供理論依據。現將結果報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2003年10月-2004年10月在陜西省漢族人群中選擇符合條件的126個家系共342例受試者進行研究。入選標準：通過篩查，選擇具有正常血壓高值或1期高血壓(收縮壓17.3～21.3 kPa和(或)舒張壓11.3～13.3 kPa、無繼發性高血壓、篩選前1個月內未使用過抗高血壓藥物)作為先證者進行家系研究；先證者若有至少2個以上子女則要求子女及配偶均參加研究。同胞、子女及配偶無血壓要求，但應排除嚴重的Ⅱ期或Ⅲ期高血壓且血壓必須低于21.3/13.3 kPa。所有的研究對象年齡應16～60歲。

1.2 基線調查及飲食干預

進行基線資料調查(人口學信息、疾病史、人體測量數據)，后給予飲食干預[17]。首先給予低鹽飲食干預：每天攝入3.0 g鹽，早餐無鹽，午餐及晚餐各1.5 g鹽，連用7 d；然后給予高鹽飲食干預：每天攝入18 g鹽，早餐3.0 g鹽，午餐及晚餐各7.5 g鹽，連用7 d。飲食干預采取統一管理、集體配餐、集中飲食的方式，配備專門的營養師負責制定食譜、監督食物的加工制作過程。

1.3 血壓測量及血壓鈉反應性

干預前及干預階段均采用英國(Hawksley & Sons)生產的隨機零點血壓計測量血壓。每次皆測量血壓3次，每次間隔30 s，求其平均值。平均動脈壓=3/2舒張壓+1/3收縮壓。最終血壓值為隨訪3 d共9次測量的血壓的平均值。將血壓對鈉的反應性看作連續性變量，分為低鹽期血壓反應性、高鹽期血壓反應性。低鹽期血壓反應性=低鹽期血壓-干預前血壓，高鹽期血壓反應性=高鹽期血壓-低鹽期血壓。

1.4 DNA的提取和基因分型

嚴格地按照ReadyAmpTM基因組DNA純化系統試劑盒進行操作提取白細胞DNA，WNK基因rs2301880位點上游引物為F:5′-TAACTGGAAGGAGACACTTATG-3′，下游引物為R：5′-CTAGACTGGCAATTGTGTCCC-3′。PCR反應體系總體積為15 μL，其中包括10×PCR緩沖液2.0 μL，25 mmol/L的MgCl21.5 μL,10 mmol/L的dNTP 0.4 μL,10 pmol/L上游引物0.25 μL，10 pmol/L下游引物0.25 μL，DNA模板1.5 μL，5×106U/L rTaq 酶0.2 μL。擴增循環參數：94 ℃ 40 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，共進行35個循環；最后72 ℃延伸5 min。擴增完畢后，在30 g/L的瓊脂糖凝膠上電泳以確定PCR產物。 連接酶鏈反應(LDR)行SNP位點檢測, 引物以及LDR探針均由上海捷瑞生物工程有限公司合成, 熒光探針設計：C：TTTTTTT-TTTTTACTTTGTGTTGCCTTGATTCCTTCC；T：TTTTTTTTTTTTTTTACTTTGTGTTGCC-TTGATTCCTTCT；S4-TR：-P-TTTGGAGGAGT-TGTCTATATAATAATTTTTTTTT-FAM。取1 μL連接產物，加10 μL上樣buffer(已混入Mar-ker)，95 ℃變性3 min，立即冰水浴。采用ABI 3730型測序儀得到分型結果。應用Genemapper軟件進行數據分析和基因分型。根據峰的大小讀取結果。

1.5 統計分析

群體基因型頻率分布采用遺傳平衡吻合度χ2檢驗以判定是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。應用FBAT 2.0.2軟件進行以家系為基礎的相關性檢驗(FBAT)，分析WNK1基因rs2301880位點多態性與血壓鈉反應性之間的關系。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 受試者血壓對鈉飲食干預的反應性

低鹽飲食可使受試者的血壓下降，而高鹽飲食則使血壓升高。同時先證者較同胞、配偶及子女等血壓變化幅度大。見表1。

表1 受試者血壓對鹽干預的反應性

2.2 WNK1基因rs2301880位點基因型和等位基因頻率分布

由于本研究基于家系人群進行的研究，故選取186名父母親受試者的基因型進行了Hardy-Weinberg平衡檢驗。經χ2檢驗，χ2=0.029，P>0.05，說明選擇的WNK1基因rs2301880位點基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，提示該樣本來自一個遺傳平衡的總體。

2.3 WNK1基因rs2301880位點與血壓的鈉反應性之間的關聯性

本實驗通過LDR-PCR測序分型方法對WNK1基因 rs2301880位點行基因分型，通過FBAT2.0.2軟件對WNK1基因rs2301880位點與鈉反應性這一數量性狀表型進行分析以后發現，rs2301880位點與高鹽期血壓反應性密切相關，分別與收縮壓(Z=1.958,P<0.05)、舒張壓(Z=2.228,P<0.05)以及中心動脈壓(Z=2.195,P<0.05)均有關系，但與低鹽期血壓反應性無關。見表2。

表2WNK1基因rs2301880位點與飲食鈉干預血壓反應性間的關系

時間等位基因收縮壓反應性Z值P值舒張壓反應性Z值P值中心動脈壓反應性Z值P值低鹽期C/T-1.1420.2530.4730.6361.2860.198高鹽期C/T 1.9580.0462.2280.0252.1950.028

3 討 論

本研究基于家系連鎖關聯分析顯示，人群對鹽負荷后血壓變化的個體性差異即血壓鈉反應性與WNK1基因多態性位點rs2301880有關，提示WNK1基因的變異可能參與了鹽敏感性高血壓的形成。

WNK1是一種位于集合管遠端腎單位絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，又稱之為無賴氨酸激酶1。人類WNK1基因位于12p13.3，其編碼的序列全長為7 149 bp，由28個外顯子組成，編碼共2 382個氨基酸，產生相對分子質量約為250 000的蛋白質。WNK1基因于2000年為由XU等[9]首先在大鼠腦組織cDNA文庫中發現的一種新的MEK激酶家族成員，由于其催化結構域中缺乏在其他激酶高度保守的賴氨酸殘基，而得名With No K kinase(K為賴氨酸縮寫)，縮略為WNK1[9-11]。近年來研究顯示，WNK1基因參與腎臟的鈉鉀轉運過程，在高血壓的形成過程中發揮重要的作用。WILCON等[11]研究顯示，WNK1基因第一內含子大片段缺失41 000 bp(736018～777314)和22 000 bp(745978～767784)后可致常染色體顯性遺傳病GORDON綜合征形成。

人群WNK1基因多態性與高血壓的發生以及血壓對飲食鈉鉀的反應也有著密切的關系。NEWHOUSE等[14]對英國712個高血壓家系進行研究發現，WNK1基因rs1468326位點多態性與收縮壓以及舒張壓有關聯；TOBIN等[15]檢測歐洲250個高血壓家系共996例受試者的24 h動態血壓發現，WNK1基因rs880054多態性位點攜帶C等位基因的受試者，收縮壓以及舒張壓分別下降0.18 kPa和0.15 kPa；PERSU等[16]通過BELHYPGEN多中心隊列研究發現，WNK1基因多態性與高血壓發生相關。同時有研究提示，WNK1基因的多態性可能與鈉鉀對血壓的影響有關。英國學者NEWHOUSE等[18]采用病例對照研究3 400例受試人群發現，有多個WNK1基因多態性位點與收縮壓、舒張壓相關，10個多態性位點與24 h尿鉀排泄量有關，且尿鉀與血壓呈負相關；日本學者OSADA等[19]研究顯示，健康受試者WNK1基因rs880054、rs956868和rs12828016位點不僅與血壓相關，且與尿Na/K比值有明顯關聯。然而這些研究大多采用病例-對照研究方法進行研究，易受到不同種族、地域之間基因型和等位基因頻率等所造成的偏倚和混雜因素的影響，同時這些研究中僅是通過尿鈉鉀含量與血壓進行相關分析得到血壓對鈉鉀的反應性，未對樣本人群進行飲食干預，因此不能有力地證實WNK1基因多態性與血壓對鈉鉀反應性之間的關系。本研究基于家系進行研究避免了人群混雜和分層偏倚，關聯分析包含了家系內部和家系之間相關信息，這對于多重假設檢驗有重要意義。其次本研究通過進行規范的7 d低鹽-7 d高鹽飲食干預，嚴格控制了飲食鈉攝入量，以飲食干預后血壓變化量來衡量血壓對鈉的反應性，方法更為準確客觀。本實驗結果顯示，WNK1基因多態性位點rs2301880與鹽干預后的血壓變化有明顯的關聯，這進一步證實WNK1基因在腎臟鈉鉀代謝中的作用，并提示其可能在鹽敏感性形成和機制中發揮重要作用。

總之，本研究基于家系和飲食干預試驗基礎上發現WNK1基因多態性與血壓對鈉干預反應性有關，結果提示WNK1基因可能參與鹽敏感性形成，同時也可能成為新的鹽敏感性分子遺傳標志，但仍有待于今后更進一步的試驗證實。

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