管灸對(duì)面神經(jīng)損傷家兔面神經(jīng)核內(nèi)BDNF及其受體TrkB表達(dá)的影響*

肖 雪 宋 軍 田豐瑋 黃靖云 趙金發(fā) 楊金蓉△

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610072；2.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川 成都 610041；3.重慶市中醫(yī)研究院，重慶 400021）

面神經(jīng)炎又稱為面癱。導(dǎo)致面神經(jīng)炎發(fā)生的原因有多種，其中以病毒感染為多見(jiàn)，但由于面神經(jīng)解剖位置表淺，外傷性或醫(yī)源性損傷（如橋小腦角腫瘤、腮腺腫瘤手術(shù)等）也可導(dǎo)致面癱［1］。目前，對(duì)于面癱的治療方法有很多［2］，比如神經(jīng)封閉、抗病毒、激素治療等，而管灸作為灸法之一，治療面神經(jīng)炎的歷史悠久，同時(shí)療效確切、操作方便、患者痛苦少、不良反應(yīng)小，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。因此，本研究制備家兔面神經(jīng)損傷模型，用免疫組織化學(xué)法觀察管灸對(duì)模型家兔面神經(jīng)核內(nèi)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）及其受體蛋白激酶B受體（TrkB）蛋白表達(dá)的影響，以期從神經(jīng)生長(zhǎng)促進(jìn)因素的角度揭示管灸的分子生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 32只健康日本大耳白兔，雌雄各半，年齡6～8個(gè)月，體質(zhì)量2～2.5 kg，由四川省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專委會(huì)養(yǎng)殖場(chǎng)提供，合格證號(hào)：SCXY（川）2013-14。動(dòng)物單籠飼養(yǎng)于四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房?jī)?nèi)，室溫約25℃，保持室內(nèi)通風(fēng)換氣，明暗交替。對(duì)實(shí)驗(yàn)用家兔觀察1周，全身無(wú)明顯畸形，無(wú)面癱則納入實(shí)驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)、管理及實(shí)驗(yàn)過(guò)程均符合衛(wèi)生部發(fā)布的《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理實(shí)施細(xì)則》。

1.2 試藥與儀器 試藥：BDNF抗體試劑盒、TrkB抗體試劑盒（BA0623）、免疫組化檢測(cè)試劑盒（SA2002）、SABC 試劑盒（SA2002）、DAB 顯色試劑盒（AR1022）皆由武漢博士德公司生產(chǎn)；多聚甲醛由成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn)。儀器：管灸器（自制）；石蠟切片機(jī)（德國(guó)徠卡儀器有限公司 ）；孵育箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；Olympus顯微鏡（日本）；Image-Pro Plus AMS 圖像分析系統(tǒng)。

1.3 分組與造模 將32只家兔隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、管灸組、熱療組，每組8只。采用神經(jīng)夾持損傷法制造面神經(jīng)損傷模型［3］，方法如下：所有動(dòng)物在術(shù)前禁食 12 h、禁水 4 h，用 0.7%戊巴比妥鈉［4］以 6 mL/kg的劑量沿家兔耳緣靜脈注射麻醉，固定后雙側(cè)面部手術(shù)區(qū)剃毛、碘伏消毒局部皮膚、鋪無(wú)菌孔巾，用手術(shù)剪于耳前至下頜角逐層切開(kāi)皮膚、皮下組織及肌肉層，切口約3 cm，鈍性分離腮腺筋膜，充分暴露面神經(jīng)，用彎鉤鑷確認(rèn)面神經(jīng)頰支后鈍性分離2.5 cm左右。用同一特定鉗于瞳孔下正對(duì)神經(jīng)干處以壓榨30 s、松開(kāi)30 s、再壓榨30 s的節(jié)律滿扣夾持面神經(jīng)，假手術(shù)組鈍性分離面神經(jīng)后，不予壓榨即行縫合術(shù)。其余各組同上法壓榨面神經(jīng)并用縫線標(biāo)記損傷段，縫合皮下及皮膚層。術(shù)后常規(guī)抗感染治療，每天肌注青霉素40萬(wàn)U，連續(xù)注射5 d。

1.4 干預(yù)方法 各組均在造模后第6日開(kāi)始治療，每日1次，治療6次后休息1 d，再治療6次。管灸組取2 g艾絨置入特制的管灸器中，點(diǎn)燃后將軟管插入家兔雙側(cè)外耳道約2 cm，施以熏灸，每次約18 min；熱療組易艾絨為燃燒的木炭同法施灸。空白組和模型組不治療，常規(guī)喂養(yǎng)。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 家兔以4%多聚甲醛全身灌注固定并處死，取動(dòng)物面神經(jīng)核，再經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片，切片常規(guī)脫蠟至水，熱修復(fù)抗原，滴加 5%BSA 封閉液，加 BDNF（稀釋度為 1∶50）、TrkB（稀釋度為 1∶100）兔抗血清 4℃過(guò)夜，SABC 法染色，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片、鏡檢，觀察蛋白表達(dá)，并用Image-Pro Plus AMS圖像分析軟件，測(cè)量積分光密度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用PEMS3.1統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析進(jìn)行比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組面神經(jīng)損傷家兔面神經(jīng)核內(nèi)BDNF蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)表1。假手術(shù)組BDNF積分光密度明顯高于模型組，有顯著差異（P＜0.05）；與模型組相比，管灸組BDNF積分光密度明顯高于模型組，有顯著差異（P＜0.05）；熱療組與模型組相比，其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果提示，面神經(jīng)損傷使家兔面神經(jīng)核中BDNF蛋白表達(dá)降低，管灸可增強(qiáng)面神經(jīng)核中BDNF的蛋白表達(dá)，而熱療組對(duì)增強(qiáng)面神經(jīng)核中BDNF的蛋白表達(dá)沒(méi)有明顯作用。

表1 各組面神經(jīng)損傷家兔面神經(jīng)核BDNF、TrkB蛋白表達(dá)比較（IOD，±s）

表1 各組面神經(jīng)損傷家兔面神經(jīng)核BDNF、TrkB蛋白表達(dá)比較（IOD，±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 n BDNF TrkB假手術(shù)組 8 39244±12454* 26977± 6810**模型組 8 17833±8381 9761±2218管灸組 8 34569±13718* 18283±7818*熱療組 8 25635±11814 12996±6601

2.2 管灸對(duì)面神經(jīng)損傷模型家兔TrkB蛋白表達(dá)的影響 見(jiàn)表1。假手術(shù)組TrkB積分光密度明顯高于模型組（P＜0.01）；管灸組與模型組相比，管灸組TrkB積分光密度高于模型組，有明顯差異（P＜0.05）；熱療組與模型組相比，其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果提示：面神經(jīng)損傷使家兔面神經(jīng)核中TrkB表達(dá)降低，管灸能增強(qiáng)面神經(jīng)核中TrkB的表達(dá)，炭灸熱療對(duì)增強(qiáng)面神經(jīng)核中TrkB的表達(dá)無(wú)明顯作用。

3 討 論

面神經(jīng)炎，中醫(yī)稱為“口僻”。以口眼歪斜，前額皺紋消失，鼻唇溝變淺，抬眉、閉眼、鼓腮等動(dòng)作障礙為主要臨床表現(xiàn)。中醫(yī)認(rèn)為，手、足陽(yáng)經(jīng)均上頭面部，當(dāng)外邪入中面部經(jīng)脈時(shí)，可致經(jīng)脈凝滯，氣血不通，肌肉緩縱不收。《靈樞.刺節(jié)真邪》曰“脈中之血，凝而留止，弗之火調(diào)，弗能取之”。管灸，是用葦管作為灸器向耳內(nèi)施灸的一種方法。因耳竅位居頭面，與手、足三陽(yáng)經(jīng)的循行聯(lián)系密切，故管灸治療可使燃艾產(chǎn)生的溫?zé)嵝?yīng)直接作用于耳竅，溫通經(jīng)脈、活血散凝，從而達(dá)到治療面神經(jīng)炎的目的［5］。

早在60年前，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子已率先由Viktor Hamburge［6］在雞的神經(jīng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中研究。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可誘導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞分化為神經(jīng)元，調(diào)控神經(jīng)元的存活及維持它們的神經(jīng)元表型，對(duì)神經(jīng)退行性疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷、腦缺血損害等諸多方面都發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族成員包括BDNF、神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3（NT-3）、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-4／5（NT-4/5）等［7］。 其中，BDNF 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)最高、分布最廣，并對(duì)多種神經(jīng)元都有廣泛作用［8-11］。BDNF幾乎能調(diào)控神經(jīng)元發(fā)育和功能的所有方面［12］，比如前體細(xì)胞增殖與分化、軸突和樹(shù)突發(fā)育、膜運(yùn)輸、突觸形成和功能、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化以及神經(jīng)元的相互作用。蔣常文等［13］認(rèn)為，星形膠質(zhì)細(xì)胞可支持神經(jīng)細(xì)胞存活并營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)元以及修復(fù)神經(jīng)損傷，BDNF可通過(guò)促進(jìn)腦星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖而維持神經(jīng)元結(jié)構(gòu)。有研究表明［14］在神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中，BDNF由靶組織產(chǎn)生并經(jīng)神經(jīng)細(xì)胞軸突逆向轉(zhuǎn)運(yùn)至胞體，可維持神經(jīng)元存活、生長(zhǎng)、分化，阻止自然誘發(fā)的、神經(jīng)傳導(dǎo)阻滯所致的神經(jīng)元死亡。

神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的生物效應(yīng)是通過(guò)其在神經(jīng)元膜上的受體介導(dǎo)的。在神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族中每個(gè)成員都有兩種受體即低親和力和高親和力受體。高親和力受體是由原癌基因編碼的酪氨酸蛋白激酶，屬于Trk受體家族，包括TrkA、TrkB、TrkC 3種亞型，TrkA優(yōu)先和NGF結(jié)合，TrkB優(yōu)先和BDNF、NT4/5結(jié)合，TrkC優(yōu)先和NT-3結(jié)合［15］。其中蛋白激酶B受體（TrkB）是相對(duì)分子量為145000，存在于神經(jīng)元表面的單跨膜糖蛋白，被公認(rèn)為是BDNF的功能受體。與BDNF特異性結(jié)合后，激活自身受體酪氨酸激酶活性，使受體TrkB發(fā)生自身磷酸化，激發(fā)下游相關(guān)信號(hào)通路，包括磷脂酰肌醇 3激酶/絲氨酶/蘇氨酶蛋白激酶（PI3K/AKT）、絲裂原活化蛋白酶（MAPK）等，最終介導(dǎo)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的生物效應(yīng)［16］。

基于BDNF-TrkB信號(hào)軸在面神經(jīng)損傷后神經(jīng)保護(hù)與神經(jīng)修復(fù)過(guò)程中均發(fā)揮廣泛而重要的作用，本研究觀察了管灸對(duì)BDNF及其受體TrkB蛋白表達(dá)的影響，以了解管灸治療面神經(jīng)炎的分子生物學(xué)機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，面神經(jīng)損傷后面神經(jīng)核內(nèi)BDNF及其受體TrkB的表達(dá)均明顯降低。然而，面神經(jīng)損傷模型家兔通過(guò)管灸治療后，面神經(jīng)核內(nèi)BDNF及其受體TrkB的表達(dá)明顯增強(qiáng)，而熱療組無(wú)明顯作用，說(shuō)明管灸可能通過(guò)上調(diào)面神經(jīng)損傷家兔面神經(jīng)核內(nèi)BDNF及其受體TrkB的表達(dá)，促進(jìn)損傷神經(jīng)元的再生和修復(fù)，從而發(fā)揮其對(duì)面神經(jīng)炎的治療作用。至于管灸促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)再生的BDNF-TrkB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

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