黃芩莖葉黃酮對大鼠急性脊髓損傷后的神經保護作用及對HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路的影響*

梅盛前 肖 捷 李 放 余海平

（浙江省建德市第一人民醫院，浙江 建德 311600）

急性脊髓損傷（ASCI）是由脊髓受到嚴重的壓迫引起的，是一種嚴重的神經系統創傷性疾病，能夠引發患者出現多功能障礙，嚴重的ASCI能夠導致患者癱瘓或死亡［1］。目前臨床上治療ASCI主要以手術治療和西藥輔助治療為主，不能從根本上減輕ASCI，且西藥不能改善ASCI后便秘癥狀。中藥以其安全、高效的特點在臨床醫學上的應用越來越廣泛［2］。黃芩莖葉黃酮（SSF）是從植物黃芩的莖葉中提取的黃酮類化合物，具有減輕炎癥損傷和氧化應激反應以及改善記憶障礙等多種作用［3］。還有研究表明，SSF能夠減輕局灶性缺血大鼠神經元損傷［4］。然而SSF對ASCI大鼠神經保護作用及對高遷移率族蛋白B1（HMGB1）/Toll樣受體4（TLR4）/核因子 κB（NF-κB）信號通路的影響尚未見報道，為此本研究對SSF對ASCI大鼠神經保護作用及潛在的分子機制進行探討，旨在為ASCI的臨床治療提供一定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Wistar大鼠72只，SPF級，雌雄各半，6～8 周齡，體質量（140±20） g，購自北京中醫藥大學東直門醫院，許可證號：SYXK（京）2015-0001。

1.2 材料與儀器 SSF購自承德醫學院中藥研究所；甲強龍（生產批號：150102，規格：40 mg）購自輝瑞制藥有限公司；兔抗鼠HMGB1、TLR4、NF-κB多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；SZ51奧林巴斯體視顯微鏡購自日本；Leica 1800切片機購自德國。

1.3 造模與分組 根據文獻資料［5］，按1 mL/100 g腹腔注射4%水合氯醛進行麻醉，將大鼠以俯臥姿固定在手術臺上，背部剪毛消毒后，于背部中線切開，去除大鼠T9～T10椎板，用質量為10 g的砝碼從5 cm高度自由落下，撞擊面直徑約為3 cm，以砝碼落下后大鼠出現搖尾反射、雙后肢及身體回縮撲動后雙后肢癱瘓為ASCI模型構建成功。假手術組只去除T9～T10椎板，但不以重物撞擊。將造模成功的大鼠隨機分成5組，每組12只，分別命名為模型組、甲強龍組、SSF低劑量組、SSF中劑量組、SSF高劑量組。甲強龍組給予40 mg/（kg·d）甲強龍［6］，SSF 組按低、中、高劑量分別給予 SSF 50、100、200 mg/（kg·d） SSF［7］，所有大鼠均行腹腔注射治療，假手術組及模型組給予等量生理鹽水，持續治療4周。

1.4 標本采集與檢測 1）脊髓運動功能（BBB）評分評定大鼠脊髓損傷情況［8］。各組大鼠膀胱排空后，晚上8點采用BBB評分法檢測各組大鼠行走及髖、膝、踝關節的協調情況，每天觀察時間為4 min。0～7分：評估恢復早期的后肢關節運動；8～13分：評估恢復中期的步態和協調運動；14～21分：評估運動時爪子的精細運動。2）HE染色檢測脊髓組織病理學變化。持續治療4周后，每組取9只大鼠進行麻醉，于無菌條件下打開胸腔，暴露心臟，用4%多聚甲醛灌注固定，直至心臟變白，解剖椎管取出損傷段脊髓，置于10%的中性甲醛溶液固定4 h。每組取3只大鼠制作組織切片，切片厚度5 μm，脫蠟后用蘇木精染色 20 min，自來水洗滌1 min，稀氨水（1%）返藍 30 s，自來水洗滌 1 min，用1%的鹽酸酒精溶液分化1 min，自來水洗滌1 min，再用伊紅染色3 min左右，自來水洗滌1 min，將組織切片逐級脫水后，二甲苯透明，中性樹膠封片，置于體視顯微鏡下觀察大鼠脊髓組織病理學變化情況。3）TUNEL檢測脊髓組織細胞凋亡情況。持續治療4周后，每組取3只大鼠脊髓組織制作石蠟切片，切片厚度5 μm。60℃烤片3 h，脫蠟后進行抗原修復，然后將玻片浸入0.1 mol/L TBS溶液放置30 min，用PBS溶液沖洗后，然后滴加50 μL TUNEL反應液，置于濕盒中37℃孵育1 h，用PBS溶液沖洗后，滴加3%的雙氧水10 min，用PBS溶液沖洗后，滴加50 μL Converter-POD，置于濕盒中37℃孵育1 h，DBA顯色后用蘇木素復染，將組織切片逐級脫水后，二甲苯透明，中性樹膠封片。正常細胞經染色后呈藍色，凋亡細胞染色后呈黃褐色，凋亡指數＝凋亡細胞數/細胞總數×100%。4）脊髓組織中HMGB1、TLR4、NF-κB表達水平。持續治療4周后，每組取3只大鼠脊髓組織，加入細胞裂解液提取總蛋白，以GAPDH為內參，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），每孔上樣體積 20 μL，電泳結束后，半干轉膜儀轉膜50 min，分別滴加一抗，置于4℃下過夜，滴加二抗37℃放置1 h。顯影后采集圖像，并采用Gel-Pro analyzer4 軟件分析 HMGB1、TLR4、NF-κB 表達水平。

1.5 統計學處理 應用SPSS 20.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，進一步比較采用q檢驗或Dunnett t檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠BBB評分比較 見表1。模型組BBB評分顯著低于假手術組（P＜0.05）；甲強龍組和SSF組BBB評分顯著高于模型組（P＜0.05）；SSF高劑量組BBB評分與甲強龍組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 各組測脊髓組織病理學變化比較 見圖1。持續治療4周后，假手術組大鼠骨髓灰白質交界清楚，神經元結構完整，且著色均勻，細胞核內核仁清晰可見；模型組脊髓壞死嚴重，出現很多空腔，灰質中神經元結構破壞，細胞核固縮；與模型組相比，甲強龍組和SSF組因壞死形成的空腔減少。

2.3 各組脊髓組織細胞凋亡情況比較 見圖2，表2。持續治療4周后，模型組脊髓細胞凋亡率顯著高于假手術組（P＜0.05）；甲強龍組和SSF組脊髓細胞凋亡率顯著低于模型組（P＜0.05）；SSF高劑量組脊髓細胞凋亡率與甲強龍組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠BBB評分比較（分，±s）

表1 各組大鼠BBB評分比較（分，±s）

與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與甲強龍組比較，#P＜0.05；與SSF低劑量組比較，◇P＜0.05；與SSF中劑量組比較，▲P＜0.05。 下同。

第14天 第28天20.57±3.02 20.73±3.17 6.52±1.31* 9.82±1.41*16.63±2.23△ 19.52±2.52△SSF 低劑量組 12 2.58±0.47△# 4.23±0.78△# 5.41±1.15△# 6.42±1.36△# 12.17±2.05△#SSF 中劑量組 12 5.51±1.23△#◇ 7.28±2.02△#◇ 9.36±1.78△#◇ 12.13±2.18△#◇ 15.86±2.31△#◇SSF 高劑量組 12 10.14±2.11△◇▲ 12.08±2.15△◇▲ 13.82±2.16△◇▲ 16.61±2.25△◇▲ 19.36±2.47△◇▲組 別 n假手術組 12模型組 12甲強龍組 12第1天 第3天 第7天19.32±3.12 19.73±3.07 20.42±3.15 0.75±0.13* 2.13±0.27* 3.75±0.54*10.06±2.06△ 12.21±2.13△ 13.92±2.15△

圖1 各組脊髓組織病理學變化（HE染色，400倍）

圖2 TUNEL檢測各組脊髓組織細胞凋亡情況（100倍）

2.4 脊髓組織中HMGB1、TLR4、NF-κB表達水平見圖3，表3。持續治療4周后，模型組脊髓組織中HMGB1、TLR4、NF-κB 表達水平顯著高于假手術組（P＜0.05）；甲強龍組和SSF組脊髓組織中HMGB1、TLR4、NF-κB 表達水平顯著低于模型組（P＜0.05）；SSF高劑量組脊髓組織中 HMGB1、TLR4、NF-κB表達水平與甲強龍組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 TUNEL檢測脊髓組織細胞凋亡情況（%，±s）

表2 TUNEL檢測脊髓組織細胞凋亡情況（%，±s）

細胞凋亡率6.57±1.34 78.47±5.47*15.72±1.73△SSF 低劑量組 12 57.36±4.13△#SSF 中劑量組 12 35.17±3.46△#◇SSF 高劑量組 12 15.61±1.92△◇▲組 別 n假手術組 12模型組 12甲強龍組 12

圖3 各組脊髓組織中HMGB1、TLR4、NF-κB表達情況

表3 脊髓組織中 HMGB1、TLR4、NF-κB 表達水平（±s）

表3 脊髓組織中 HMGB1、TLR4、NF-κB 表達水平（±s）

HMGB1 TLR4 NF-κB 0.25±0.03 0.38±0.04 0.21±0.01 0.91±0.08* 1.17±0.12* 1.02±0.10*0.28±0.03△ 0.52±0.05△ 0.39±0.03△SSF 低劑量組 12 0.71±0.07△# 0.92±0.09△# 0.81±0.08△#SSF 中劑量組 12 0.48±0.06△#◇ 0.73±0.07△#◇ 0.60±0.06△#◇SSF 高劑量組 12 0.31±0.04△◇▲ 0.49±0.05△◇▲ 0.41±0.06△◇▲組 別 n假手術組 12模型組 12甲強龍組 12

3 討 論

ASCI是由外界沖擊和壓迫引起的脊髓神經功能障礙，是一種高致殘性的神經系統創傷性疾病，嚴重威脅患者的身體健康和生命安全［9］。據不完全統計，全世界脊髓損傷發生率高達755例/百萬，每年的新增病例高達83例/百萬人，死亡人數約占其中的69%，近年來，隨著交通事故等不良事件的發生，ASCI的發生率逐年攀升［10］。脊髓損傷患者的臨床癥狀主要表現為局灶性出血、組織水腫以及炎性細胞浸潤［11］。其病理改變主要表現為灰質和白質損傷，甚至引起神經細胞的凋亡。因此，探究安全、高效的藥物是治療ASCI的重點。

甲強龍是治療ASCI的常用藥物，然而西醫治療ASCI具有一定的局限性。中醫對ASCI的發病機制具有更深的理解，中醫學認為ASCI是由外力損傷督脈導致氣血瘀阻，屬于“痿躄”“瘀證”“體惰”范疇［12］。 因此，中醫治療ASCI以活血化瘀、通脈活絡、益氣補血為主［13］。SSF是從中藥黃芩中提取的黃酮類化合物，具有多種藥理活性。程建軍等研究表明，SSF通過抑制神經細胞凋亡減輕β-淀粉樣蛋白所致的大鼠記憶障礙［14］。王玉梅等研究表明，SSF通過抑制腦內炎性細胞因子的生成改善腦缺血大鼠神經功能［15］。王玉梅研究表明還表明，SSF通過調控腦內天門冬氨酸受體和血管內皮生長因子的表達發揮對腦缺血大鼠的神經保護作用［16］。以上研究均表明，SSF具有減輕記憶障礙和神經保護功能，推測SSF對ASCI大鼠也具有神經保護作用。本研究表明，甲強龍組和SSF組BBB評分顯著高于模型組（P＜0.05）；SSF高劑量組BBB評分與甲強龍組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）；HE染色結果顯示，模型組脊髓壞死嚴重，出現很多空腔，灰質中神經元結構破壞，細胞核固縮；與模型組相比，甲強龍組和SSF組因壞死形成的空腔減少，以上結果提示，SSF對ASCI大鼠神經具有保護功能。甲強龍組和SSF組脊髓細胞凋亡率顯著低于模型組（P＜0.05）；SSF高劑量組脊髓細胞凋亡率與甲強龍組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。提示SSF能夠抑制ASCI大鼠神經細胞凋亡。

SSF對ASCI大鼠神經具有保護功能的作用機制尚未完全明確。高遷移率族蛋白B1（HMGB1）是細胞核內重要的DNA結合蛋白，能夠調控DNA的重組、基因的復制、修復和轉錄。近年來有研究表明，HMGB1是一種重要的免疫輔佐劑，能誘導T淋巴細胞釋放免疫因子，進而激活免疫應答反應，減輕機體炎癥損傷［17］。楊晶等研究表明，降低脊髓組織中HMGB1表達水平能夠減輕脊髓損傷后炎癥反應，進而發揮對其神經的保護作用［18］。TLR4和NF-κB是參與機體免疫反應的重要的蛋白質分子。張立才研究表明，通過抑制脊髓損傷大鼠TLR4炎癥通路能夠抑制神經細胞凋亡，進而發揮其神經保護功能［19］。還有研究表明，抑制脊髓損傷大鼠NF-κB通路能夠抑制機體炎癥反應，進而發揮其神經保護功能［20］。以上研究表明，HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路在機體的免疫應答反應中發揮著重要作用。本研究表明，甲強龍組和SSF組脊髓組織中HMGB1、TLR4、NF-κB 表達水平顯著低于模型組（P＜0.05）；SSF高劑量組脊髓組織中 HMGB1、TLR4、NF-κB表達水平與甲強龍組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。提示，SSF可能通過下調脊髓組織中HMGB1、TLR4、NF-κB表達水平，減輕炎癥損傷，抑制神經細胞凋亡來發揮其神經保護功能。

綜上所述，SSF對ASCI大鼠神經具有保護作用，這一作用可能通過調控HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路實現的，為ASCI的臨床治療提供一定的理論基礎。

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