清腸溫中方對DSS誘導慢性潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠Th1/Th2平衡的干預作用*

石 磊 韓亞飛 劉佳麗 丁龐華 孫中美原文靜 郭 一 賈博宜 陳曉偉 李軍祥△

（1.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院，北京 100078）

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是一種好發(fā)于結(jié)直腸黏膜、黏膜下層的非特異性炎癥性疾病，是炎癥性腸病的主要類型之一。臨床上以腹瀉、黏液膿血便、里急后重等腸道表現(xiàn)為主，同時可能伴有營養(yǎng)不良、焦慮抑郁或多系統(tǒng)不同的腸外表現(xiàn)，病情嚴重者甚至出現(xiàn)威脅生命的情況。UC的發(fā)病機制目前尚不明確，多數(shù)觀點認為是由于環(huán)境、感染等因素刺激，引起遺傳易感的宿主發(fā)生不恰當?shù)拿庖哐装Y反應(yīng)從而發(fā)病［1］，而免疫因素在UC的發(fā)病中起主導作用，甚至不少學者認為UC屬于自身免疫性疾病，其中，T細胞的Th1/Th2亞群平衡失調(diào)可能是UC發(fā)病的重要機制之一。根據(jù)T細胞介導免疫功能及分泌的細胞因子不同，可以將T細胞分為Th1和Th2兩個主要的亞群，前者主要分泌IFN-γ、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）等因子介導細胞免疫和炎癥反應(yīng)；后者通過分泌白介素-4（IL-4）、白介素-5（IL-5）和白介素-13（IL-13）等介導體液免疫和抗炎反應(yīng)［2］。兩者在健康個體的體內(nèi)維持著動態(tài)平衡，當一方過度優(yōu)勢等情況致使平衡失調(diào)，則會誘發(fā)UC的發(fā)生。筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn)清腸溫中方可以明顯改善UC患者的病情，降低疾病活動指數(shù)和修復腸黏膜，并對DSS誘導的急性UC大鼠有一定的治療作用。因此本實驗擬通過葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導小鼠慢性UC模型，觀察清腸溫中方對Th1/Th2平衡的干預作用，為清腸溫中方尋找可能的免疫作用靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級健康雄性BALB/c小鼠90只，體質(zhì)量（20±2）g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0011，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學SPF級動物房，12 h光照/12 h黑夜循環(huán)，溫度（22±2）℃，濕度 50%～60%，自由飲食飲水。

1.2 試藥與儀器 清腸溫中浸膏方（黃連6 g，炮姜10 g，三七6 g，木香6 g，炙甘草6 g等）由北京中醫(yī)藥大學中藥學院提供；陽性對照藥美沙拉嗪緩釋顆粒（艾迪莎，國藥準字H20143164）購自北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院外購藥房；葡聚糖硫酸鈉（DDS，160110，相對分子質(zhì)量36000～50000）購自美國MP Bio公司；便潛血試劑盒（中國珠海，BA-0202B）、4%多聚甲醛（SL1830）購自中農(nóng)博信（北京）科技有限公司；小鼠IL-1β（EK0394）、IL-4（EK0405）、IL-5（EK0408）、IL-6（EK0411）、TNF-α（EK0527）酶聯(lián)免疫吸附 ELISA 試劑盒均購于武漢博士德生物工程有限公司；抗NF-κB p50（ab28849）抗體購自美國Abcam公司。

1.3 分組與造模 BALB/c小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，采用隨機數(shù)字表法將90只小鼠隨機分為空白組、模型組、清腸溫中方高劑量組（3.2 g浸膏/kg，臨床患者2倍用藥量）、清腸溫中方中劑量組（1.6 g浸膏/kg，臨床患者正常用藥量）、清腸溫中低劑量組（0.8 g浸膏/kg，臨床患者0.5倍用藥量）和美沙拉嗪組（606.7 mg/kg，臨床患者正常用藥量）共6組，每組15只，結(jié)合文獻［3］和臨床患者用藥量確定給藥劑量。采用改良的自由飲用 3%（w/v）DSS 方法復制慢性 UC 模型［4］。所有小鼠進食普通維持飼料，空白組小鼠實驗期間均不予干預，其余小鼠自由飲用由蒸餾水配置的3%DSS溶液，溶液每天新鮮配置，共7 d。第8天起改為飲用蒸餾水，共7 d，以上14 d為1個周期，整個模型復制階段共3個周期，合計42 d。第43天起所有小鼠飲用蒸餾水，同時連續(xù)14 d給予相應(yīng)藥物灌胃干預（0.1 mL/10 g），模型組用蒸餾水進行對照灌胃。

1.4 標本采集與檢測 1）疾病活動指數(shù)（DAI）［5］。實驗期間每天記錄小鼠體質(zhì)量，觀察一般情況和便質(zhì)，化驗便潛血。體質(zhì)量下降率：無下降記0分；1%～5%記1分；5%～10%記2分；10%～15%記3分；大于15%記4分。便質(zhì)：正常0分，稀軟便2分；水樣便4分；便潛血：陰性0分；陽性2分；肉眼血便4分。2）血清細胞因子含量。實驗終點采用眼球取血，將小鼠一側(cè)胡須減去，充分暴露該側(cè)眼球，用眼科鑷摘除眼球，收集血液標本，靜置 1 h，低溫離心機離心 15 min（3000 r/min），收集淡黃色透亮血清，分裝后冷凍備用。3）NF-κB p50蛋白表達。在裝有碎冰的培養(yǎng)皿上取距肛門4 cm處結(jié)腸標本1 cm，于4%多聚甲醛溶液固定，石蠟切片包埋，4 μm切片，抗原修復后采用DAB顯色法免疫組化染色觀察NF-κB p50蛋白表達。采用平均光密度值（AOD＝IntDen/Area）代表 NF-κB p50 蛋白的具體染色程度。

1.5 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料用（±s）描述，用單因素方差分析進行檢驗，方差齊用LSD檢驗，不齊用T2檢驗，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.01認為有顯著差異。計數(shù)資料、等級資料用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）描述，用多個獨立樣本非參數(shù)檢驗的K-W H檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學差異，P＜0.01為有顯著差異。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠DAI評分及一般情況比較 見表1。隨著飲用DSS溶液時間的延長，小鼠出現(xiàn)腹瀉、黏液膿便、甚至肉眼血便的癥狀加重，同時伴有體質(zhì)量逐漸減輕，且癥狀在飲用藥物3 d后明顯加重。在造模第1周期內(nèi)小鼠癥狀表現(xiàn)明顯，病情嚴重，每組均有死亡現(xiàn)象發(fā)生，后2個周期的癥狀表現(xiàn)較前均有所減輕，死亡數(shù)量也較前減少。藥物干預后除模型組外，各組小鼠便血、腹瀉癥狀有不同程度減輕，體質(zhì)量逐漸恢復并增加，實驗終點DAI評分結(jié)果提示模型組疾病程度明顯重于空白組（P＜0.01），清腸溫中方和美沙拉嗪干預后的評分均有所降低（P＜0.05）。

表1 各組DAI評分比較（分）

2.2 各組小鼠血清細胞因子含量比較 見表2。與空白組比較，模型組小鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β明顯升高（P＜0.01），IL-4和 IL-5明顯減少（P＜0.01）。藥物干預后各組與模型組相比，清腸溫中方各劑量和美沙拉嗪均能降低 TNF-α、IL-6 和 IL-1β（P＜0.05）并增加IL-4和IL-5（P＜0.05），其中以清腸溫中方中劑量組和美沙拉嗪組作用最明顯。

表2 各組小鼠血清細胞因子含量比較（pg/mL，±s）

表2 各組小鼠血清細胞因子含量比較（pg/mL，±s）

組 別 n IL-6 IL-1β 204.44±11.63 263.15±55.47 481.22±25.52*634.14±58.76*262.68±17.89△ 281.38±21.65△清腸溫中方中劑量組 10 220.77±18.98△ 533.46±26.85△ 499.65±30.38△ 245.75±20.00△ 275.74±55.20△清腸溫中方低劑量組 9 276.26±18.25△ 523.60±50.71△ 448.18±29.04△ 283.62±12.53△ 299.92±38.54△美沙拉嗪組 10 211.87±38.97△ 532.76±34.91△ 493.70±36.23△ 247.96±13.23△ 276.71±24.35△空白組 15模型組 8清腸溫中方高劑量組 9 TNF-α IL-4 IL-5 199.32±12.65 567.83±40.38 569.57±15.53 397.00±60.08*291.19±51.32*330.05±34.49*247.08±37.23△ 526.72±53.60△ 460.78±24.76△

2.3 各組小鼠NF-κB p50蛋白表達比較 見表3，圖1。小鼠結(jié)腸組織免疫組化染色后發(fā)現(xiàn)，空白組結(jié)腸組織表達極少量NF-κB p50蛋白，且表達位置主要位于細胞質(zhì)；模型組在腸道結(jié)構(gòu)紊亂消失的基礎(chǔ)上，與空白組比較表達明顯增多（P＜0.01），且表達位置主要位于細胞核。藥物干預后，與模型組相比，清腸溫中方高、中劑量和美沙拉嗪組均能減少NF-κB p50蛋白表達（P＜0.05），表達位置在細胞質(zhì)中為主，其中以中劑量組和美沙拉嗪組的效果最為明顯。

表3 各組小鼠NF-κB p50蛋白表達比較（平均光密度值，±s）

表3 各組小鼠NF-κB p50蛋白表達比較（平均光密度值，±s）

組 別 n空白組 15模型組 8清腸溫中方高劑量組 9 NF-κB p50 0.29±0.05 0.75±0.05*0.52±0.05△清腸溫中方中劑量組 10 0.44±0.03△清腸溫中方低劑量組 9 0.60±0.07△美沙拉嗪組 10 0.40±0.06△

圖1 各組NF-κB p50蛋白免疫組化圖（DAB染色，200倍）

3 討 論

本研究采用反復飲用DSS溶液復制慢性UC模型，其中DSS誘導的化學性結(jié)腸炎腸上皮損傷與人類UC的表現(xiàn)相似，其機理是溶于水后的硫酸化多糖作為一種化學毒素可以直接作用于腸上皮細胞并產(chǎn)生破壞［6］，導致腸腔多種抗原進入腸黏膜，激活黏膜免疫并產(chǎn)生無法控制的炎癥級聯(lián)反應(yīng)和過度的免疫應(yīng)答［7］。

人類腸道具有復雜的免疫系統(tǒng)，可以減輕消除病原體的感染，同時保持上皮細胞對食物抗原和非致病菌的耐受性［8］。腸上皮表面的黏液層中含有的大量抗菌物質(zhì)和分泌性IgA，是腸黏膜免疫的第一道防線；其次，腸上皮細胞及其分泌的抗菌肽、先天性、適應(yīng)性免疫細胞將共同起到調(diào)節(jié)黏膜免疫系統(tǒng)功能的作用。腸黏膜免疫細胞特異性的形成了腸道相關(guān)淋巴組織（GALT），細菌等抗原在GALT中激活免疫細胞從而發(fā)揮免疫效應(yīng)［9］。適應(yīng)性免疫針對不同抗原有著強大的特異性，T細胞在UC的發(fā)病中起著舉足輕重的作用。T細胞有多個不同的細胞亞群，可分泌不同的細胞因子并誘導相應(yīng)的免疫反應(yīng)，其中Th1、Th2通過不同的細胞因子相互影響，維持著細胞和體液免疫功能的平衡發(fā)揮。有研究指出UC可能是Th1、Th2細胞共同作用而引起的發(fā)病［8］，因此恢復Th1/Th2平衡在UC的治療中可能是作用靶點之一。

在接受來自上皮細胞的損傷信號后，樹突狀細胞驅(qū)使幼稚T細胞分化成Th1和Th2不同表型，并分泌關(guān)鍵細胞因子 IFN-γ、TGF-β、IL-4、IL-5 和 IL-13 等，這些不同的細胞因子負責炎癥發(fā)展、持續(xù)的組織損傷和病理改變，包括異常的黏液分泌、纖維化、組織重塑，平滑肌細胞增生和高反應(yīng)性等［9］。Th1細胞主要分泌TNF-α、IL-6等炎癥因子并發(fā)揮促炎作用，而腸黏膜組織中的NF-κB受到上游不同因素調(diào)控發(fā)生激活后入核進行轉(zhuǎn)錄，加重炎癥級聯(lián)反應(yīng)［10］。本實驗發(fā)現(xiàn)模型組小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量明顯升高，腸黏膜中NF-κB p50表達明顯增多且大多位于細胞核內(nèi)，而血清IL-4、IL-5抗炎因子含量明顯降低，說明DSS誘導的慢性UC模型中，以Th1為主的免疫應(yīng)答占主導，Th2細胞相對處于弱勢，Th1/Th2處于失衡狀態(tài)并偏向前者。當采用清腸溫中方或美沙拉嗪治療后，抗炎因子 IL-4、IL-5 有所升高，促炎因子 TNF-α、IL-6、IL-1β較前減少，腸黏膜中NF-κB p50表達減少，并以細胞質(zhì)中表達為主，說明清腸溫中方和美沙拉嗪可以相對提升Th2類細胞亞群，抑制相對亢進的Th1細胞，促進Th1/Th2平衡狀態(tài)并恢復免疫系統(tǒng)正常功能。本研究發(fā)現(xiàn)IL-4、IL-5在治療后含量明顯高于其余炎性因子，考慮與慢性UC模型有關(guān)，這也與文獻［11］報道UC晚期病程以Th2型免疫反應(yīng)為主的現(xiàn)象相吻合。

清腸溫中方是北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院消化科李軍祥教授總結(jié)多年臨床經(jīng)驗而創(chuàng)，他認為UC病位在腸，與脾胃關(guān)系密切，病機多屬脾陽不足、濕熱夾瘀，當以健脾溫中、清熱化瘀法則治療，已在臨床UC治療中收獲確切療效。有學者［12-14］提出Th1/Th2失衡是溫病濕熱證共同的致病機制之一，并通過實驗證實了清熱祛濕類方藥具有不同程度改善Th1/Th2失衡的作用，本研究發(fā)現(xiàn)清腸溫中方的清熱燥濕治法也正具備調(diào)節(jié)這兩類免疫細胞亞群的功效。姚茹冰等［15］發(fā)現(xiàn)三七總皂苷可以抑制類風濕關(guān)節(jié)炎患者外周血Th1分泌的IFN-γ，促進Th2分泌IL-4從而恢復二者平衡。研究發(fā)現(xiàn)葛根芩連結(jié)腸定位片具有降低家兔血清及結(jié)腸組織Th1細胞因子IL-1β和TNF-α并提高Th2細胞因子IL-4、IL-13的表達，調(diào)整兩類免疫細胞亞群的作用［16］。此外，采用利濕和血湯聯(lián)合美沙拉嗪治療UC患者后，可以顯著調(diào)控多種細胞因子的表達［17］，這些都與我們研究發(fā)現(xiàn)的清腸溫中方通過恢復Th1/Th2平衡從而起到治療UC的作用一致。

對于慢性UC小鼠，清腸溫中方不僅可以降低Th1細胞增加Th2細胞，促使二者平衡的恢復，還能減少NF-κB的激活入核，起到治療疾病的作用。但Th2細胞的主導優(yōu)勢是否會對UC后期的恢復存在影響作用，清腸溫中方能否調(diào)控以Th2為主的Th1/Th2失衡，有待進一步的研究。

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