解脲棒狀桿菌與尿液中磷酸銨鎂結晶形成的相關性

李采青， 曹 靜， 詹明華， 韓旭穎， 李小鳳， 劉金祿

（河北北方學院附屬第一醫院微生物科，河北 張家口 075000）

解脲棒狀桿菌是一種需氧、無芽胞革蘭陽性棒狀桿菌，是引起泌尿系統感染的重要病原菌。因其迅速分解尿素并利用其生長，導致高氨尿和堿性尿，使尿液中磷酸鹽、碳酸磷灰石和尿酸銨等成分過于飽和，從而易產生磷酸銨鎂結晶并形成感染性結石。為了解從泌尿系統感染的尿液中分離的解脲棒狀桿菌與磷酸銨鎂結晶的關系，本研究對用超高倍顯微鏡觀察到磷酸銨鎂結晶的尿液進行細菌培養，分析細菌構成，并將解脲棒狀桿菌置于無菌、無污染尿液中培養，觀察磷酸銨鎂結晶情況，以確定其是否影響磷酸銨鎂結晶的形成，旨在為臨床抗感染治療、防止感染性結石的形成提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 選取2015年1月—2016年12月來河北北方學院附屬第一醫院就診的門診和住院患者送檢至微生物科超高倍顯微鏡室的尿液樣本，其中檢出磷酸銨鎂結晶陽性尿液46例[患者男31例，年齡（63.29±15.41）歲；女15例，年齡（63.60±12.49）歲]，無磷酸銨鎂結晶尿液40例[患者男20例，年齡（44.86±13.75）歲；女20例，年齡（41.64±17.96）歲]。均按要求留取患者中段尿于無菌容器立即送檢。解脲棒狀桿菌分離自磷酸銨鎂結晶尿液。

1.1.2 儀器與試劑 ACT-2000超高倍顯微成像系統（上海復星公司）， pH精密試紙（杭州特種紙業有限公司），KDC-40低速離心機（科大創新股份有限公司中佳分公司），PHONEX100全自動細菌鑒定/藥物敏感性系統（美國BD公司），UF-1000i全自動尿有形成分分析儀及配套試劑（日本Sysmex公司）。

1.2 方法

1.2.1 原尿液鏡檢 取10 mL尿液于離心管中，以400×g離心5 min棄上清，剩余沉渣為0.2 mL，混勻吸取沉渣分別置于2張載玻片上，一張用于直接涂片并做革蘭染色，另一張用24 mm×24 mm蓋玻片壓片，用超高倍顯微鏡觀察全片。

1.2.2 磷酸銨鎂結晶陽性尿液細菌培養及鑒定 取10 μL 尿液接種于5%羊血瓊脂平板和麥康凱瓊脂平板上，置35 ℃孵箱中培養24～48 h，根據菌落形態、菌落計數、染色特點初步判斷，用Phonex100全自動細菌鑒定/藥物敏感性系統進行鑒定。

1.2.3 實驗菌株在尿液中的培養 將無菌、無污染、無各種結晶、無紅細胞和白細胞尿液置于無菌帶蓋試管中（約2 mL/管），將解脲棒狀桿菌、大腸埃希菌、奇異變形桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌和腸球菌分別配制成0.5麥氏濁度菌懸液，分別取10 μL菌懸液加入上述裝有尿液的試管中，每份尿液均設立空白對照，置35 ℃孵箱中培養24和48 h。

1.2.4 實驗菌株在尿液中培養后的磷酸銨鎂結晶鏡檢 取培養液20 μL于載玻片上，用24 mm×24 mm蓋玻片壓片，用超高倍顯微鏡觀察結晶形態，保存結晶圖像。

1.2.5 結晶顯微鏡判定 磷酸銨鎂結晶有很強的折光性，可見洋信封狀、方柱狀、立方體、未成形羽毛狀等形態。

1.2.6 尿液有形成分的分析 嚴格按照儀器說明書進行尿液分析。參考區間：pH值5.5～6.5，結晶數量0～10個/μL，細菌0～6 000個/μL，白細胞0～30個/μL。

2 結果

2.1 磷酸銨鎂結晶陽性尿液解脲棒狀桿菌的陽性率

在46例檢出磷酸銨鎂結晶的尿液中，細菌培養陽性25例（陽性率54.3%），其中男性患者尿液17例（陽性率54.8%）、女性患者尿液8例（陽性率53.3%）。12例尿液培養出2種病原菌。解脲棒狀桿菌8株（陽性率32.0%），其中有2株與腸球菌、1株與大腸埃希菌、1株與白念珠菌混合生長，來自女性1株、男性7株。磷酸銨鎂結晶陽性尿液中的細菌種類及構成比見表1。

表1 磷酸銨鎂結晶陽性尿液中的細菌種類及構成比

2.2 磷酸銨鎂結晶陽性尿液的主要特點

尿液pH值7.0～7.5 7例、8.0～8.5 31例、9.0以上8例；結晶數量在參考區間內35例，＞10個/μL 11例；細菌數量在參考區間內37例，＞6 000個/μL 9例；白細胞在參考區間內11例，＞30個/μL 35例。

2.3 解脲棒狀桿菌在尿液中繁殖后形成磷酸銨鎂結晶培養液的pH值

空白對照管中尿液的pH值為5.4～7.0，解脲棒狀桿菌培養液的pH值均＞9.0。

2.4 解脲棒狀桿菌和其他實驗菌株在無結晶尿液繁殖后形成磷酸銨鎂結晶的情況

對分離的8株解脲棒狀桿菌選擇其中4株與尿液混合培養后，20例女性患者尿液中有9例（結晶形成率為75.0%），20例男性患者尿液中有15例（結晶形成率為45.0%）有磷酸銨鎂結晶形成，4株解脲棒狀桿菌在尿液中的磷酸銨鎂結晶形成情況和結晶形態均一致。實驗菌株磷酸銨鎂結晶形成情況見表2。

2.5 解脲棒狀桿菌在無結晶尿液中繁殖后磷酸銨鎂的結晶形態

表2 實驗菌株在無結晶尿液中繁殖后磷酸銨鎂結晶形成情況 （例）

解脲棒狀桿菌在無磷酸銨鎂結晶的尿液繁殖后可觀察到方柱狀、立方體、未成形羽毛狀、洋信封狀等結晶形態，以未成形羽毛狀多見；同一培養液中可觀察到不同形態的磷酸銨鎂結晶，48 h后可觀察到磷酸銨鎂結晶體積變大、變厚且有聚集現象。見圖1～圖3。

圖1 磷酸銨鎂洋信封狀結晶

圖2 磷酸銨鎂未成形方柱狀結晶

圖3 磷酸銨鎂未成形立方體結晶

3 討論

泌尿系統感染是泌尿外科和腎內科常見疾病，臨床上常做尿液干化學分析和尿液培養[1]，忽視尿沉渣顯微鏡鏡檢。泌尿系統感染分解尿素的病原體后可在尿路中形成磷酸銨鎂結晶，磷酸銨鎂結晶是尿沉渣檢驗中常見的結晶之一，正常或病理情況下均可形成，也是形成感染性結石的基礎，是泌尿系統感染發生的原因之一[2]。

本研究對超高倍顯微鏡下觀察到磷酸銨鎂結晶的尿液進行細菌培養，結果顯示細菌陽性率為54.3%，共分離出病原菌9種，具有尿素酶的細菌（解脲棒狀桿菌、奇異變形桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌）占50%以上。解脲棒狀桿菌陽性率為32.0%（8/25），可見在形成磷酸銨鎂結晶的泌尿系統感染中解脲棒狀桿菌是重要病原菌之一。體外實驗顯示解脲棒狀桿菌在男性或女性患者尿液中生長繁殖時尿液中均有磷酸銨鎂結晶形成，48 h男性患者結晶的形成率[75.0%（15/20）]高于女性患者[45.0%（9/20）]，其可能與女性和男性飲食習慣不同有關，這種差異是否真實存在還需要增加樣本量或檢查尿液中無機鹽的濃度加以確定[3]。在由具有尿素酶的奇異變形桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌等引起的泌尿系統感染患者的尿液中均有磷酸銨鎂結晶形成，而在由不具有尿素酶的大腸埃希菌和腸球菌引起的泌尿系統感染患者的尿液中沒有磷酸銨鎂結晶形成或形成較少。本研究結果顯示，具有不同產尿素酶能力的細菌在無結晶的尿液中繁殖時其磷酸銨鎂結晶的形成能力不相同，解脲棒狀桿菌于24 h形成結晶例數最多，隨著時間增加例數沒有增加，這是由于解脲棒狀桿菌具有豐富的尿素酶之故。奇異變形桿菌形成結晶例數次之，銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯菌形成結晶例數最少，隨著繁殖時間的延長形成結晶的例數增加。體外實驗結果顯示，解脲棒狀桿菌在無磷酸銨鎂結晶的尿液中繁殖后可見方柱狀、立方體、未成形羽毛狀、洋信封狀等不同形態結晶，隨著培養時間的延長，磷酸銨鎂結晶體積變大、變厚、聚集，趨向形成結石，可見解脲棒狀桿菌在引起泌尿系統感染和感染后形成感染性結石的過程中具有重要作用。正常人尿液中包含有機物和無機物的代謝產物，如尿素、氨基酸、肌酐、尿酸等和Na+、K+、Cl-、PO3-、Mg2+、SO4

2-等，有些物質可作為細菌生長所必須的營養物質和磷酸銨鎂結晶形成的無機鹽類。解脲棒狀桿菌具有豐富的尿素酶，可迅速分解尿素產氨，使尿液pH值增加，以利于細菌生長，尿液在短時間內呈堿性，氨與水結合形成銨離子、碳酸離子，銨與尿中鎂離子和磷酸根結合，形成磷酸銨鎂結晶以及碳酸磷灰石結晶等，進而形成感染性結石。磷酸銨鎂等鹽類形成的感染性結石生長比較快、復發率高，給患者帶來巨大的痛苦。分離出解脲棒狀桿菌的患者多具有男性、高齡、長期留置導尿管的特點，臨床應引起重視。老年人排尿不暢，長期留置導尿管或尿路任何部位的狹窄、梗阻、憩室都可使尿液滯留，而尿液滯留繼發泌尿系統感染，泌尿系統感染又有利于結石形成[4]。

解脲棒狀桿菌是條件致病菌，可引起人體急性膀胱炎、結痂性膀胱炎、潰瘍結痂性腎盂腎炎、尿路結石等泌尿系統感染。解脲棒狀桿菌在血瓊脂平板上生長緩慢，24 h菌落細小或沒有形成可見的菌落，在常規細菌培養中容易被漏檢。在留取尿液時樣本常會受到尿道口快速生長細菌的污染，與其他快速生長細菌和真菌混合感染時，其他細菌迅速生長會掩蓋解脲棒狀桿菌的生長，這也是在泌尿系統感染病原菌統計結果中很少有解脲棒狀桿菌的原因。本研究結果顯示有4株解脲棒狀桿菌與腸球菌、大腸埃希菌和白念珠菌混合生長。解脲棒狀桿菌呈多重耐藥[5]，對于特定的人群，如老年、男性以及長期留置導尿管的患者更應重視，積極進行尿沉渣鏡檢和細菌培養，避免形成持續慢性感染，防止結晶、結石形成，因此臨床和實驗室應當密切聯系，共同提高解脲棒狀桿菌的檢出率，使患者早日得到正確的診斷和治療。

呂純莉等[6]報道影響尿有形成分分析儀檢測的因素很多，聯合使用尿干化學和尿有形成分分析，也不能完全代替人工顯微鏡檢查。結晶是尿沉渣分析項目之一，但由于磷酸銨鎂結晶等結晶不會被染色、大小不等、呈復合多面內部結構，在全自動尿有形成分分析儀常規檢驗中不能被明確種類。當由具有尿素酶的細菌引起泌尿系統感染時，尿常規顯示尿液pH值＞7.0，并含大量白細胞、紅細胞、細菌及結晶[7]；解脲棒狀桿菌引起感染的尿常規顯示尿液pH值≥8.0，白細胞和細菌或結晶陽性。臨床和實驗室對特定人群應重視尿沉渣鏡檢和細菌培養，明確磷酸銨鎂結晶的存在和細菌種類，積極早期預防或依照藥物敏感性試驗結果進行抗菌藥物治療，有效控制感染和防止感染性結石的形成。

[1]范宏佳，湯瑾，王堅鏹，等. 尿常規檢測在尿路感染診斷中的價值[J]．檢驗醫學，2014，29（12）：1207-1211．

[2]高振利，劉慶祚. 泌尿系結石的微創治療[M]．北京：人民衛生出版社，2011：232-239.

[3]李采青，韓旭穎，曹靜，等. 泌尿系感染常見細菌對尿液磷酸銨鎂結晶的影響[J]．現代檢驗醫學雜志，2017，32（2）：131-134．

[4]吳在德，吳肇漢. 外科學[M]．7版. 北京：人民衛生出版社，2008：680．

[5]吳玲，魏超君，魏勤，等. 4 例從臨床堿性尿液標本中分離的解脲棒狀桿菌的鑒定及耐藥性分析[J].臨床檢驗雜志，2015，33（7）：557-558．

[6]呂純莉，肖代敏，朱紹玲，等. URIT-1500尿干化學分析儀與AVE-764B尿有形成分分析儀聯合尿液檢測復檢規則的制定和應用[J]．檢驗醫學，2016，31（1）：45-48．

[7]高逢彬. 泌尿系感染性結石的成因及診治現狀[J]．泌尿外科雜志（電子版），2015，7（4）：51-54．