瞬時(shí)受體電位通道5時(shí)間分辨熒光免疫分析法的建立和驗(yàn)證

陸揚(yáng)帆， 黃 飚， 馬 鑫

（1.江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 無錫 214000；2.江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所，江蘇 無錫 214063）

細(xì)胞膜瞬時(shí)受體電位通道5（transient receptor potential channel 5，TRPC5）是一類具有四聚體結(jié)構(gòu)的非選擇性陽(yáng)離子通道，對(duì)Ca2+通透，參與細(xì)胞對(duì)滲透壓反應(yīng)的調(diào)控[1-2]。有研究結(jié)果表明，細(xì)胞膜微泡（extracellular vesicle，EV）是耐藥乳腺腫瘤細(xì)胞受到藥物刺激后特異性從乳腺腫瘤細(xì)胞表面通過細(xì)胞膜出芽方式大量生成的直徑為100～500 nm的膜泡，該EV包裹化療藥物并攜帶TRPC5等關(guān)鍵蛋白進(jìn)入血循環(huán)[3-5]，TRPC5或許可作為乳腺癌耐藥診斷的標(biāo)志物。本研究采用時(shí)間分辨熒光免疫分析法（time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）建立了TRPC5 TRFIA。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

MUC1 抗體（ab70475）購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，Sulfo-SMCC、KLH、Sulfolink Resin 購(gòu)自美國(guó)Pierce公司，福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，TRPC5多肽標(biāo)準(zhǔn)品由上海強(qiáng)耀生物科技有限公司合成。透析袋購(gòu)自美國(guó)Viskase公司，PD-10柱購(gòu)自美國(guó)BioRad公司，免疫磁珠購(gòu)自蘇州Beaver公司，Auto DELFIA 1235全自動(dòng)TRFIA檢測(cè)儀為美國(guó)PE - Wallac公司產(chǎn)品。

1.2 試劑的配制

1.2.1 TRPC5標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制 將TRPC5標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成0 、5 、10 、20 、40 、50 、80 、100 、200、400、500 、800 和1 000 ng/mL系列濃度，稀釋液為0.1 mol/L pH值7.5的磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）。

1.2.2 β2緩沖液 分別稱量9 g NaCl、5 g牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、20 μmol 二乙烯三胺五乙酸和0.5 g NaN3，定容至1 L，調(diào)節(jié)pH值為7.8。

1.2.3 洗脫緩沖液 分別稱量9 g NaCl、3 g BSA、1 g NaN3，定容至1 L，調(diào)節(jié)pH值為7.8。

1.2.4 包被緩沖液 分別稱量1.59 gNa2CO3、2.96 g NaHCO3，定容至1 L，調(diào)節(jié)pH值為9.6。

1.2.5 平衡緩沖液 分別稱量0.9 g NaCl、1.59 g Na2CO3、2.96 g NaHCO3，定容至1 L，調(diào)節(jié)pH值為8.5。

1.3 方法

1.3.1 抗TRPC5多克隆抗體的制備 由上海強(qiáng)耀生物科技有限公司制備。抗TRPC5多克隆抗體TRPC5多肽是一種半抗原，沒有免疫原性，故采用TRPC5與血藍(lán)蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）耦聯(lián)作為免疫抗原免疫新西蘭大白兔。具體方法為：第1天，取抗原1 mL加入1 mL福氏完全佐劑，乳化，于大白兔頸背部皮下多點(diǎn)注射；第14、28、42天，每次取抗原1 mL加入1 mL福氏不完全佐劑，乳化，于大白兔頸背部皮下多點(diǎn)注射；第52天，于頸動(dòng)脈取血，將大白兔處死，兔血在4 ℃放置過夜，4 ℃ 10 000×g離心30 min，收集上清；親和純化血清后，將其分裝備用。

1.3.2 黏蛋白（mucin1，MUC1）包被磁珠的制備 參考免疫磁珠試劑盒方法包被磁珠，具體步驟為：取50 μg MUC1用平衡緩沖液配成濃度 ≥3.0 mg/mL 的蛋白溶液，取500 μL磁珠懸浮液于1.5 mL聚丙烯離心管中，將聚丙烯離心管置于磁性分離架內(nèi)，富集磁珠，棄上清液，加1 mL 2～8 ℃的洗滌液A于離心管中，渦旋15 s，使磁珠混合均勻。將Eppendorf管置于磁性分離架內(nèi)，富集磁珠，去除上清液。加200 μL蛋白溶液于聚丙烯離心管中，渦旋30 s，使其混合均勻。將聚丙烯離心管渦旋15 s，置于垂直混合儀上，4 ℃反應(yīng)過夜。采用磁性分離架富集磁珠，加1 mL 封閉液于Eppendorf管中，渦旋30 s，將Eppendorf管置于磁性分離架內(nèi)，富集磁珠，棄上清液。加1 mL 封閉液于聚丙烯離心管中，渦旋30 s，將聚丙烯離心管置于垂直混合儀中室溫反應(yīng)2 h。將聚丙烯離心管置于磁性分離架內(nèi)，富集磁珠，棄上清液。加1 mL 超純水于聚丙烯離心管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，棄上清液。加1 mL 儲(chǔ)存液于聚丙烯離心管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，棄上清液。重復(fù)該操作2次，加入1 mL 儲(chǔ)存液于聚丙烯離心管中，充分混合，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 包被板固相抗原的制備 將TRPC5多肽用包被緩沖液稀釋成0.19 μg/L的包被液，在96孔包被板中各孔加100 μL，震蕩混勻，4 ℃放置過夜。棄去包被液，拍干殘留液體后，每孔加入200 μL含3 g/L BSA的上述緩沖液封閉，室溫放置2 h。棄去封閉液，拍干殘留液體后，于烘箱中干燥，置-20 ℃保存。

1.3.4 Eu3+-羊抗兔抗體的制備 取溶解于50 mmol/L PBS pH值7.0緩沖液的羊抗兔抗體5～10 mg，經(jīng)截留相對(duì)分子質(zhì)量為50 000的超濾管轉(zhuǎn)換緩沖體系，將緩沖體系換為平衡緩沖液。取500～1 000 μL轉(zhuǎn)換緩沖體系后的羊抗兔抗體于1.5 mL 離心管中，加入0.2～0.4 mg的Eu3+-N2-[p-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸，25 ℃震蕩混合，反應(yīng)過夜。反應(yīng)液經(jīng)用80 mmol/L 三羥甲基氨基甲烷-HCl pH值7.8緩沖液平衡的Sepharose CL-6B柱（1 cm×40 cm）層析，稀釋分裝備用。

1.3.5 檢測(cè)步驟 （1）樣本預(yù)處理：為了盡可能排除血清中其他因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，先進(jìn)行樣本預(yù)處理。用促凝血清管采集新鮮血液，1 000×g離心5 min后收集上清；用包被有MUC1抗體的免疫磁珠與收集到的上清于25 ℃震蕩孵育1 h；用磁力架吸附磁珠，棄去上清液，用PBS柔和清洗磁珠；用磁力架吸附磁珠，棄去上清液，再用PBS重懸作為待測(cè)樣本。（2）TRPC5 TRFIA檢測(cè)步驟：取包被有包被原（TRPC5多肽）的96孔包被板，加50 μL TRPC5標(biāo)準(zhǔn)品或已經(jīng)用MUC1磁珠預(yù)處理過的待測(cè)樣本到各自的微孔中，加50 μL用洗脫緩沖液稀釋的抗TRPC5抗體，于25 ℃振蕩孵育1 h，洗滌4次，加入用β2緩沖液稀釋的100 μL Eu3+-羊抗兔抗體，于25 ℃振蕩孵育1 h，洗滌6次，加入200 μL增強(qiáng)液振蕩5 min后測(cè)量熒光強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本中的TRPC5含量。

1.3.6 離心法收集血清樣本中的EV 收集血清樣本，按梯度進(jìn)行離心： 以4 000×g 4 ℃離心10 min，取上清；以12 000×g 4 ℃離心30 min，取上清；以100 000×g 4 ℃離心2 h，棄去上清，PBS重懸沉淀，收集EV。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)分析采用配對(duì)t檢驗(yàn)及兩變量的相關(guān)和回歸分析。以p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗TRPC5抗體稀釋

在TRPC5多肽板條中加分析緩沖液稀釋的不同濃度的抗TRPC5抗體，抑制率為最高濃度（1∶50稀釋）兔血清結(jié)合率的30%～50%時(shí)對(duì)應(yīng)的稀釋度為1∶1 000～1∶2 000，因此合適的工作濃度應(yīng)在此范圍內(nèi)，選擇1∶1 000稀釋。見圖1。

2.2 TRPC5多肽固相抗原包被量的優(yōu)化

用包被液將TRPC5多肽稀釋為不同濃度進(jìn)行包被，采用TRPC5 TRFIA檢測(cè)，作各濃度點(diǎn)熒光強(qiáng)度的雙對(duì)數(shù)函數(shù)曲線，見圖2。當(dāng)TRPC5固相抗原包被量為0.19 μg/mL時(shí)，其曲線的斜率較大，不同濃度TRPC5多肽區(qū)分度較高，因此固相抗原選用濃度為0.19 μg/mL TRPC5的多肽進(jìn)行包被。

圖1 TRPC5 TRFIA抗體稀釋度曲線

圖2 不同濃度TRPC5多肽包被的TRPC5 TRFIA標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 TRPC5 TRFIA的考核

TRPC5 TRFIA的結(jié)果經(jīng)對(duì)數(shù)函數(shù)處理所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。

圖3 TRPC5 TRFIA標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.1 方法的敏感性和穩(wěn)定性 以零劑量點(diǎn)熒光強(qiáng)度x -2s后的熒光強(qiáng)度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到的相應(yīng)值為檢測(cè)的敏感性，TRPC5 TRFIA的敏感性為1 ng/mL。精確度測(cè)量范圍變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）＜10 %，即TRPC5濃度為5～500 ng/mL，見圖4。運(yùn)用TRPC5 TRFIA檢測(cè)，3個(gè)效應(yīng)點(diǎn)檢測(cè)值ED80、ED50、ED20分別為（4.68±0.13）、（321.66±2.77）和（714.42±4.07）ng/mL。說明劑量反應(yīng)曲線的位置漂移較小，方法的穩(wěn)定性較好。

圖4 TRPC5 TRFIA精確度曲線

2.3.2 方法的精密度和回收率 隨機(jī)抽取的96孔微孔板反應(yīng)條經(jīng)Eu3+-羊抗兔抗體示蹤的結(jié)果見表1。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各孔計(jì)數(shù)值CV為5.5%，其中4條反應(yīng)板的CV均＜10.0%，說明此種96孔微孔板各孔的均一性及重復(fù)性良好，完全能夠滿足TRFIA的要求。見表1。

以健康女性樣本為空白血清基質(zhì)，在其中添加不同量的TRPC5標(biāo)準(zhǔn)品，使其最終濃度為 0～1 000 ng/mL，應(yīng)用TRPC5 TRFIA檢測(cè)各個(gè)樣本TRPC5的濃度，計(jì)算回收率，見表2。5個(gè)空白添加樣本的平均回收率為94.61%，不同加樣量的平均空白加樣回收率均在85.00%～115.00%之間，能滿足免疫分析的要求，表明該方法具有較好的準(zhǔn)確性。

表1 96孔板均一性測(cè)定

表2 間接TRFIA測(cè)定樣本中TRPC5的回收率

2.3.3 TRPC5 TRFIA的臨床應(yīng)用 收集臨床血清樣本，乳腺癌化療耐藥患者21例，化療耐受尚可患者21例，正常對(duì)照者12名，使用TRPC5 TRFIA檢測(cè)乳腺癌來源TRPC5含量，結(jié)果見圖5。正常對(duì)照組與化療耐受尚可組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而化療耐藥組與化療耐受尚可組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.000 1）。

2.3.4 MUC1磁珠富集EV與離心收集EV效果的比較 將上述收集到的血清樣本，用超高速離心方法分離收集其中的EV，取與磁珠富集方法收集EV過程中等量的血清所收集到的EV，直接使用TRPC5 TRFIA檢測(cè)其中TRPC5的含量，并與磁珠富集方法收集EV的結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，2種方法檢測(cè)的結(jié)果呈正相關(guān)（r2=0.695 8，p＜0.000 1）。見圖6。

圖5 TRPC5 TRFIA臨床檢測(cè)結(jié)果

圖6 磁珠富集EV與離心收集EV的相關(guān)性

3 討論

乳腺癌是女性常見的腫瘤，嚴(yán)重威脅女性的身心健康。化學(xué)藥物治療是乳腺癌的主要治療手段之一，但90%以上腫瘤患者死于不同程度的化療耐藥。對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥已經(jīng)成為腫瘤治療的一大難題。目前，早期診斷腫瘤的最新、最有效的方法是檢測(cè)血中的腫瘤標(biāo)志物。腫瘤標(biāo)志物是指在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的過程中，能反應(yīng)細(xì)胞癌變的一些細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)。臨床上通過對(duì)各種腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)，可以對(duì)相應(yīng)腫瘤進(jìn)行早期診斷、療效觀察和腫瘤復(fù)發(fā)狀況監(jiān)測(cè)[6-7]。因此，在深入研究耐藥機(jī)制的基礎(chǔ)上，開發(fā)腫瘤耐藥分子的診斷指標(biāo)、方法，實(shí)現(xiàn)試劑化，從而做到耐藥早期動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，在現(xiàn)階段對(duì)于乳腺癌耐藥的診療至關(guān)重要，也為優(yōu)化藥物結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、研發(fā)耐藥逆轉(zhuǎn)藥物提供有益借鑒，因而具有重大而現(xiàn)實(shí)的社會(huì)價(jià)值。

MUC1在正常細(xì)胞表達(dá)時(shí)是一種跨膜糖蛋白，正常情況下，在乳腺、胃腸道及泌尿生殖道的上皮細(xì)胞頂端表達(dá)，糖基化完全。MUC1對(duì)正常上皮起潤(rùn)滑和保護(hù)、介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞黏附作用。在乳腺癌細(xì)胞株MCF-7中通過磷酸化，MUC1能結(jié)合Rrb/SOS，參與受體酪氨酸激酶介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而酪氨酸磷酸化是膜受體參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的一個(gè)關(guān)鍵步驟[8]。乳腺癌MUC1的表達(dá)特點(diǎn)為：高表達(dá)、異常表達(dá)低；糖基化、高唾液酸化；頂端定位不清，極性混亂；細(xì)胞漿和細(xì)胞表面都有過度表達(dá)，并且這些分子會(huì)從乳腺癌細(xì)胞進(jìn)入血清。基底樣乳腺癌患者高表達(dá) MUC1，約有92% 的患者能檢測(cè)出過表達(dá)的MUC1。

免疫磁珠，也稱免疫磁性微球，是一種均勻、具有超順磁性及保護(hù)性殼的球形小粒子，基本上由載體微球和免疫配基結(jié)合而成。免疫磁珠技術(shù)，是一種以特異的抗原抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)的免疫學(xué)檢測(cè)和分離技術(shù)，以抗體包被的磁珠為載體，通過抗體與反應(yīng)介質(zhì)中特異性抗原結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物，此復(fù)合物在外加磁場(chǎng)的作用下發(fā)生定向移動(dòng)，從而達(dá)到分離抗原的目的[9-10]。

TRFIA是超微量檢測(cè)領(lǐng)域中一項(xiàng)新興的檢測(cè)技術(shù)，在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)方面已得到長(zhǎng)足發(fā)展，其是利用免疫反應(yīng)的高度特異性與標(biāo)記示蹤物的高度敏感性相結(jié)合而建立的一類微量物質(zhì)檢測(cè)技術(shù)。全自動(dòng)TRFIA檢測(cè)限為10～18 mol/L，大大優(yōu)于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的10-10mol/L和放射免疫法的10-12mol/L，所以世界衛(wèi)生組織推薦將此技術(shù)作為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的超微量檢測(cè)技術(shù)[11]。采用TRFIA進(jìn)行TRPC5檢測(cè)的敏感性可達(dá)1 ng/mL，檢測(cè)范圍可達(dá)5～500 ng/mL，根據(jù)臨床樣本檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)其對(duì)于乳腺癌化療耐藥及化療耐受尚可患者有一定的區(qū)分能力，值得加大臨床樣本量進(jìn)行進(jìn)一步分析。

[1]MARINA M， SAAVEDRA H I. Nek2 and Plk4：prognostic markers， drivers of breast tumorigenesis and drug resistance[J]. Front Biosci （Landmark Ed）， 2014， 19：352-365.

[2]MONTELL C. The TRP superfamily of cation channels.[J]. Sci STKE， 2005， 2005（272）：re3.

[3]MA X， CAI Y， HE D， et al. Transient receptor potential channel TRPC5 is essential for P-glycoprotein induction in drug-resistant cancer cells[J]. Proc Natl Acad Sci U S A， 2012， 109（40）：16282-16287.

[4]MA X， CHEN Z， HUA D， et al. Essential role for TrpC5-containing extracellular vesicles in breast cancer with chemotherapeutic resistance[J]. Proc Natl Acad Sci U S A， 2014， 111（17）：6389-6394.

[5]馬鑫， 金堅(jiān)， 汪淋軍，等. EVs-TRPC5在檢測(cè)乳腺癌耐藥程度中的應(yīng)用： CN 103954770 A[P].2014-07-30.

[6]HANASH S M， PITTERI S J， FACA V M. Mining the plasma proteome for cancer biomarkers[J].Nature， 2008， 452（7187）：571-579.

[7]楊文蔚， 王志恒， 岳朝艷. 乳腺癌患者血清CA153、CEA、鐵蛋白和降鈣素水平的變化及臨床意義[J]. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2017，32（4）：308-310.

[8]周龍， 雷建平， 李瑤. 粘蛋白（MUC1）與腫瘤的關(guān)系[J]. 江西醫(yī)藥， 2008，43（4）：364-367.

[9]張璇， 鮮瑤. 免疫磁珠技術(shù)及其在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用[J]. 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全， 2011，1：40-43.

[10]盛躍穎，陳洪友，張曦，等. 免疫磁珠捕獲法檢測(cè)志賀菌的模擬研究[J]. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)， 2012， 27（3）：167-170.

[11]朱嵐，黃飚，張玨，等. 甲狀腺球蛋白抗體競(jìng)爭(zhēng)TRFIA技術(shù)的建立及臨床應(yīng)用[J]. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2013， 28（4）：305-307.