抗核抗體與EB病毒抗體水平的關系

張敏杰， 高玉芳

（咸陽市中心醫院，陜西 咸陽 712000）

EB病毒 （Epstein-Barr virus，EBV）是一種普遍存在的γ-皰疹病毒，世界范圍內有＞90%的人被其感染，其通過在B細胞內表達限定數量的病毒抗原而實現潛伏性感染。EBV急性感染可導致50%的年輕人出現傳染性單核細胞增多癥（infectious mononucleosis，IM），并出現大量的病毒復制。據推測，IM患者發展成為多發性硬化（multiple sclerosis，MS）和其他自身免疫性疾?。╝utoimmune disease，AID）的風險增加了20倍[1]。因為EBV感染引起的IM發生區域與MS的患病區域有相似之處，所以IM患者更易患MS。對MS患者體內的EBV特異性抗體進行檢測，發現MS患者血清中EBV核抗原（EBV nuclear antigen，EBNA-1）IgG水平明顯升高[2]。國外有文獻報道，在系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）患者體內EBNA-1 IgA和EBV-衣殼抗原（virus capsid antigen，VCA）IgA滴度升高，EBV-早期抗原（early antigen，EA）/D IgA的陽性率為58%，然而健康對照者血清EBVEA/D IgA檢測呈陰性[3]。雖然EBV與淋巴瘤形成之間的關系日益明確[4]，但其在自身免疫性反應中的作用尚不明了。這些EBV相關的AID可能是由具有不同遺傳背景的人體內EBV的免疫調節能力發生改變引起的。本研究通過對比分析抗核抗體（anti-nuclear antibody，ANA）、抗可提取性核抗原（extractable nuclear antigen，ENA）抗體與EBV抗體水平的關系，探討EBV感染狀態對自身抗原免疫反應調節的作用。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

80例樣本均來自2015年12月—2017年2月咸陽市中心醫院門診就診或住院采用間接免疫熒光法檢測ANA為陽性的患者，其中男8例、女72例，年齡（50.4±17.7）歲。80例樣本中抗ENA抗體陽性樣本74例。分離血清，置-70 ℃保存待測。以體檢中心的48名體檢健康者為健康對照組，其中男5名、女43名，年齡（48.9±18.5）歲，無自身免疫性疾病及家族史，ANA和抗ENA抗體均為陰性。

1.2 ANA的檢測

采用間接免疫熒光法檢測ANA，試劑盒來源于德國歐蒙公司。每個反應區同時有Hep-2細胞系和猴肝組織2種抗原基質，Hep-2細胞及猴肝組織均無特異性熒光為陰性，Hep-2細胞及猴肝組織產生明顯特異性熒光為陽性。根據熒光模式對ANA進行分型，熒光較暗、核型不易區分者為弱陽性。

1.3 抗ENA抗體譜的檢測

采用免疫印跡法體外定性檢測血清或血漿中的人抗nRNP/Sm、Sm、SS-A/Ro、SS-A/Ro-52、SS-B/La、Scl-70、Jo-1、CENP B、ds-DNA、核小體、組蛋白、核糖體P蛋白12種不同抗原IgG類抗體，試劑盒由德國歐蒙公司提供，結果在歐蒙公司提供的軟件上進行分析。臨界值計為陰性。操作按試劑盒說明書進行。

1.4 抗EBV抗體的檢測

采用酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測EBVVCA IgM、EBV-VCA IgG、EBV-EA IgG和EBNA-1 IgG，試劑盒由德國歐蒙公司提供。按試劑盒說明書進行操作。用ELx800酶標儀（美國Bio-Tek公司）在450 nm波長處進行比色，測定每個孔的吸光度（A）值。通過計算患者樣本或對照血清A值與標準品A值的比值定性判斷EBV-VCA IgM結果，比值≥1.1為陽性。EBV-VCA IgG、EBVEA IgG和EBNA-1 IgG以3份標準血清的濃度和A值分別為橫、縱坐標點對點作標準曲線，根據此標準曲線求出血清中抗體的濃度。對A值超出標準品1（200 RU/mL）的樣本進行1∶400稀釋后重新測定，根據標準曲線計算出的數據乘以4即為樣本中抗體的濃度。以EBVVCA IgG、EBV-EA IgG和EBNA-1 IgG≥22 RU/mL為陽性。

1.5 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統計分析?？笶BV抗體陽性率的比較采用Pearson χ2檢驗。定量資料呈偏態分布，用中位數（四分位數）[M（P25，P75）]描述，2組間比較采用Mann-Whitney U檢驗，多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗。以p＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ANA陽性患者與健康對照者血清抗EBV抗體水平的比較

ANA陽性組血清EBV-VCA IgM陽性4例（5.00%），EBV-VCA IgG陽性80例（100.00%），EBV-EA IgG陽性25例（31.25%），EBNA-1 IgG陽性80例（100.00%）。健康對照組血清未見EBVVCA IgM陽性反應，EBV-VCA IgG陽性47例（97.92%）；EBV-EA IgG陽性6例（12.50%），EBNA-1 IgG陽性45例（93.75%）。ANA陽性組EBV-EA IgG陽性率明顯高于健康對照組（χ2=5.747，P=0.017）。ANA陽性組血清EBVVCA IgG、EBV-EA IgG和EBNA-1 IgG水平較健康對照組明顯升高（Z值分別為-5.59、-2.64、-4.52，p＜0.01）。見表1。

表1 ANA陽性組和健康對照組血清抗EBV抗體水平的比較 [RU/mL，M（P25，P75）]

2.2 抗ENA抗體陽性組與陰性組抗EBV抗體水平的比較

在抗ENA抗體譜中，抗SS-A/Ro抗體、抗SS-B/La抗體陽性組分別與抗SS-A/Ro抗體、抗SS-B/La抗體陰性組比較EBNA-1 IgG水平明顯升高（Z=-2.630，P=0.008；Z=-2.515，P=0.011），EBV-VCA IgG 和EBV-EA IgG水平差異無統計學意義（P＞0.05）。抗核小體抗體陽性組與抗核小體抗體陰性組比較EBV-VCA IgG、EBV-EA IgG水平明顯升高（Z=-2.355，P=0.018；Z=-2.017，P=0.043），但2組之間EBNA-1 IgG水平差異無統計學意義（P＞0.05）?？笴ENP B抗體陽性組與抗CENP B抗體陰性組比較EBNA-1 IgG水平明顯降低（Z=-2.25，P=0.024）。見表2。

表2 抗ENA抗體陽性組與陰性組抗EBV抗體水平的比較 [RU/mL ，M（P25，P75）]

2.3 ANA陽性患者抗ENA抗體陽性個數與抗EBV抗體水平的關系

抗ENA抗體譜中自身抗體陽性個數不同的ANA陽性患者EBV-EA IgG水平不同（χ2=11.380，P=0.023），從抗ENA抗體陰性到自身抗體陽性個數≥4，ANA陽性患者血清EBV-EA IgG水平升高。但自身抗體陽性個數為2個和自身抗體陽性個數為3個的患者，EBVEA IgG水平分布差異無統計學意義（Z=-1.65，P=0.100）?？笶NA抗體譜中自身抗體陽性個數不同的患者EBV-VCA IgG和EBNA-1 IgG水平差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 抗ENA抗體陽性個數與抗EBV抗體水平 [RU/mL，M（P25，P75）]

3 討論

現有的研究結果表明，EBV具備在活動性的裂解復制感染周期與潛伏狀態之間相互轉變的能力[5]。在原發感染期，宿主細胞內的EBV是以裂解復制感染周期的方式存在，EBV裂解周期抗原EBV-EA/D既可位于受感染細胞的細胞質內，也可存在于細胞核內，其與病毒DNA聚合酶所處的位置相同，對病毒基因的復制非常重要。原發性EBV感染急性期EBV-VCA IgG通常到達峰值較遲，并且衰退較慢，急性期以后EBV-VCA IgG能夠以相對穩定的滴度持續存在。原發感染后，EBV通常進入潛伏期，為了逃避宿主細胞的免疫殺傷，僅表達少量的基因產物。這一時期EBNA-1充當著復制因子的角色。因此，EBNA-1 IgG的存在排除了急性感染情況，提示感染處于既往感染期。一旦EBV由潛伏感染進入到裂解復制感染周期時，EBV-EA/D是其表達的第1個抗原，并且EBV-EA/D是免疫系統發揮作用的明確目標。

本研究通過比較ANA陽性患者與ANA陰性健康對照者血清抗EBV抗體水平，發現EBV-VCA IgM的陽性率在ANA陽性患者與健康對照者間并沒有明顯差異，但ANA陽性患者血清EBV-EA IgG陽性率明顯高于健康對照者（p＜0.017）。同時，ANA陽性患者血清EBVVCA IgG、EBV-EA IgG和EBNA-1 IgG水平比健康對照者明顯升高（p＜0.01）。本研究結果與文獻結果[6]相符。EBV-EA/D在EBV裂解復制感染周期中對病毒基因復制起到重要的作用，推測可能是EBV復發感染或慢性反復持續感染導致患者ANA出現陽性反應之故。但EBV復發感染或慢性持續感染為何會導致ANA出現陽性反應，HARLEY等[7]研究發現，狼瘡抗體的產生源于抗EBNA-1抗體的體液免疫應答，EBNA-1抗原表位傳播導致抗SSA/Ro抗體和抗SmB抗體產生。另有研究結果表明，SLE患者外周血單個核細胞中出現EBNA-1和潛伏膜蛋白1的表達增加[8]。如果原發性EBV感染急性期或復發感染是SLE發病的重要機制，那么Harley等的研究結果則與這一假設不謀而合。有研究結果表明，抗ds-DNA抗體是SLE患者的特異性標志抗體，是診斷及判斷SLE患者疾病活動性的重要指標之一[9]。某些臨床診斷為混合性結締組織病和系統硬化癥的患者也檢出抗ds-DNA抗體陽性，可能與患者全身結締組織受累有關。佟大偉等[10]用間接免疫熒光法、ELISA及放射免疫法檢測抗ds-DNA抗體，120例SLE患者3種方法檢出抗ds-DNA抗體陽性率分別為25%、32%和32%。楊林等[11]用ELISA、免疫印跡法及間接免疫熒光法檢測98例AID（類風濕性關節炎、未分化結締組織病、多發性肌炎/皮肌炎、系統性硬化癥、原發性干燥綜合征等）患者抗ds-DNA抗體的陽性率分別為11.9%、7.1%和5.1%。本研究80例ANA陽性患者并未確診是否為SLE患者或其他AID患者，抗ds-DNA抗體陽性率為11.25%（9/80）?？筪s-DNA抗體陽性組與抗ds-DNA抗體陰性組比較EBV-VCA IgG、EBV-EA IgG和EBNA-1 IgG均無差異。但9例抗ds-DNA抗體陽性組EBNA-1 IgG水平[183.30（134.06，312.63）RU/mL]高于71例抗ds-DNA抗體陰性組[160.40（94.30，481.33）RU/mL]。由于抗ds-DNA抗體與SLE密切相關，因此EBV潛伏感染產物EBNA-1 IgG水平升高可能誘發SLE。然而，這需要加大抗ds-DNA抗體陽性樣本量以進一步評價。

EBV具有嗜B淋巴細胞的特性，大多數EBV感染者處于潛伏狀態，EBNA-1為其潛伏感染狀態下的病毒表達產物。在外界某些因素的刺激下，病毒的潛伏感染狀態被破壞，病毒進入裂解復制感染周期，這一過程中病毒基因表達大量病毒產物，促進病毒在宿主細胞中散播，造成宿主免疫系統紊亂。據報道SSA/Ro和EBNA-1蛋白具有高度同源性[12]。本研究對比分析了抗ENA抗體譜中各種自身抗體與抗EBV抗體水平的關系，發現抗SS-A/Ro抗體陽性組與抗SS-A/Ro抗體陰性組比較，抗SS-B/La抗體陽性組與抗SS-B/La抗體陰性組比較，EBNA-1 IgG水平均明顯升高（p＜0.05），EBV-VCA IgG和EBV-EA IgG水平未見差異，本研究結果與文獻結果[13]相符。同時，抗CENP B抗體陽性組與抗CENP B抗體陰性組比較，EBNA-1 IgG水平明顯降低（P=0.024），結果發現13例抗CENP B抗體陽性患者其抗SS-A/Ro抗體基本為陰性。這一結果印證了EBNA-1與自身抗原SS-A/Ro具有同源性，EBNA-1誘導機體產生的特異性EBNA-1 IgG抗體反應與SS-A/Ro發生交叉反應，從而在AID的發生、發展中起重要作用。此外，本研究發現抗核小體抗體陽性組與抗核小體抗體陰性組比較，EBV-VCA IgG、EBV-EA IgG水平明顯升高（p＜0.05）。隨著抗ENA譜中自身抗體個數的增多，EBV-EA IgG水平明顯升高（P=0.023）。總之，本研究結果更進一步說明了自身抗體與EBV免疫反應之間的緊密關系。然而，需要更大量的同質性種群研究來深入闡述病毒在自身免疫機制中的作用。

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