實時定量熒光PCR法檢測清真食品中狐貍源性成分

賈冰凝 何微 岳苑 吳明 張慧玲

摘 要：根據狐貍線粒體DNA（mtDNA）序列設計了狐貍特異性引物和探針，建立了食品中狐貍源性成分的實時熒光PCR檢測方法。該方法的檢測靈敏度可達0.1pg，而且與常見的12個物種無交叉反應，可作為食品中狐貍源性成分鑒別的有效方法。

關鍵詞：實時熒光PCR 狐貍源性 線粒體DNA 清真食品

中圖分類號：TS207 文獻標識碼：A 文章編號：1674-098X（2017）12（c）-0109-03

我國少數民族眾多，遍布各個省份，其中回族、維吾爾族、哈薩克族等少數民族信奉伊斯蘭教。他們在飲食、起居等方面形成了獨具特色的風俗習慣，尤其在飲食方面有著嚴格的宗教特色禁忌，禁食奇形怪狀、污穢不潔、性情兇惡、行為怪異的飛禽、猛獸及魚類等食物以及不反芻的動物，如豬、狗、貓、鼠、蛇、驢、馬、騾、狗、狐貍等[1]。

狐貍作為一種經濟附加值很高的畜類，在中國廣泛養殖，人們主要通過飼養狐貍獲取其皮毛制作衣服、圍巾等產品。在將狐貍剝去皮后，剩余的肉及內臟就成為了“廢物”，一些不法商販將廢肉低價買入再將其送往食品加工廠做成牛肉、羊肉、狗肉等制品并高價賣出，從中獲得暴利。由于狐貍肉沒有通過檢驗檢疫，帶有大量的病毒、細菌、寄生蟲，而且為了得到光澤好的高質量的皮毛，養殖戶會給狐貍喂食激素。這不僅僅是食品安全問題，更涉及到人們身體健康和宗教信仰等問題[1]。因此，對于肉制品中摻假的檢測顯得尤其重要。

動物源性檢測手段主要有蛋白分析法和核酸分析法，但由于蛋白分析法要求樣品不能經過高溫等能使蛋白變性的烹飪手段，這就極大地限制了其在實際生活中的應用[1]。隨著分子生物學的進步，PCR技術很好地解決了這一問題。實時定量熒光PCR可以實時檢測目標片段的表達情況，是目前檢測食品中動物源性成分的主要手段，它有著專一性強、對樣品加工程度要求低等特點[2]。目前已有關于豬、牛、羊、馬、驢、兔[4-5]動物源性成分分析的報道，但采用實時定量熒光PCR法檢測清真食品中狐貍源性還鮮有報道。本實驗選擇狐貍線粒體設計引物和探針，建立快速準確地檢測清真食品中狐貍源性成分的實時定量熒光PCR檢測方法，給食品摻假檢測以及規范清真食品市場提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品及來源

肉及其制品包括牛、羊、豬、魚、雞、鴨、鵝、鴿子、鵪鶉、驢、馬、狗、狐貍。豬、牛、羊、魚、雞、鴨、鵝、鴿子、鵪鶉采購自超市，驢、馬采購自餐館，狐貍采購自銀川市西夏區兆群狐貍養殖合作社，犬血液購自銀川市興慶區寵康動物診所。

1.1.2 實驗試劑

基因組DNA提取試劑盒購自于大連TAKARA公司； PCR擴增純化試劑盒，購自于Promager公司。

1.1.3 實驗儀器

實時熒光定量PCR儀（Eppendorf公司）；高速冷凍離心機（日本HTACHI公司）；恒溫加熱器（HAITEC公司）。

1.1.4 引物及探針的設計

根據NCBI基因數據庫中公布的基因數據，選擇狐貍細胞色素b基因[3]，在線粒體DNA的區域設計了用于檢測狐貍DNA的特異性引物和探針，此外，為了防止假陰性結果的出現以及監控PCR反應的正常與否，在真核生物的16sRNA保守區域設計了通用上下游引物。引物及探針的序列見表1。

1.2 方法

1.2.1 樣品DNA的提取

采用TAKARA公司基因組DNA提取試劑盒，具體步驟：

（1）稱取10mg樣品加入Ep管中，充分剪碎；（2）70℃加熱10min，其間指彈2～3次；（3）12000rpm、4℃離心10min，取200μL上清于新離心管中備用。陰性樣品同樣通過該法提取DNA，溶解于100μL TE溶液中備用。

1.2.2 實時熒光PCR反應

反應體系40μL：PCR Mix25μL，上游引物（10μM）1μL，下游引物（10μM）1μL，探針（5μM）2μL，模板DNA（10～50ng）2μL，無菌水補至40μL。

反應條件為：50℃保溫2min，95℃預變性2min，95℃變性15s、60℃延伸45s進行40個循環，同時擴增目標物和內參。

1.2.3 特異性實驗

為了考察本研究特異性，取1.1中所有樣品的制作模板。根據1.2.2的反應體系和反應條件分別擴增。通用引物同步擴增[5]。

1.2.4 靈敏度實驗

將狐貍DNA溶液稀釋至10%、1%、0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%、0.00001%，以含量不同的狐貍DNA樣品為模板，進行PCR反應，用于確定方法的靈敏度。

1.2.5 重復性與穩定性驗證

將狐貍DNA作為模板，按照1.2.2所述的反應體系與反應條件進行擴增，同一模板進行7次擴增反應，研究所建立體系的穩定性。

2 結果與討論

2.1 狐貍源性成分特異性分析

用設計的狐貍源性引物和探針分別對12種樣品的DNA進行實時熒光PCR，結果如表2所示，Ct值的平均值為15.16，其余物種均無擴增，由此可見本研究所設計的狐貍源性引物和探針特異性良好。

2.2 靈敏度試驗結果

用特異性的引物和探針，以狐貍DNA含量分別為10%、1%、0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%和0.00001%為模板擴增，結果見圖1和圖2。由圖1和圖2可知：當狐貍成分含量低至0.0001%時，仍能夠呈現S型擴增曲線并且Ct值<35，說明本方法可檢出10-4ng的DNA量，因此方法的靈敏度為0.1pg。在10%至0.00001%濃度范圍內，建立Ct值-DNA含量的標準曲線，R2為0.996，線性相關度良好。

2.3 重復性與穩定性試驗結果

狐貍源性成分重復性試驗結果Ct值見表3。經統計學分析表明，實驗穩定性和重復性良好，結果無顯著性差異。

3 討論與結論

3.1 目的基因的選擇

之所以會選擇線粒體細胞色素b，是因為狐貍的細胞色素b相對使用其余DNA片段作為物種鑒定的靶序列具有以下優點：（1）細胞色素b具有廣泛的種內和種間多樣性，比核DNA進化速度快，適于親緣相近物種的鑒別。（2）每個線粒體含2～6個環狀DNA，在數量上遠超過核DNA，適于加工樣品的分析。（3）細胞色素b在不同的物種中具有較高的變異性，特異性較強。

3.2 檢出限的確定

狐貍源性成分靈敏度試驗0.1%、0.01%含量檢測的Ct值均<35.0，但是為了區分偶然性和蓄意摻假，同時考慮檢測過程中的實際意義，將檢出限確定為0.1%。

參考文獻

[1] 岳苑.實時熒光PCR法檢測清真食品中馬、驢源性成分[J].湖北農業科學，2014，53（22）：5519-5521.

[2] 陳茹，林志雄，劉琳琳.應用PCR等核酸技術檢驗動物飼料中牛羊組織成分[J].中國獸醫科技，2001，31（9）：3-8.

[3] 曹際娟，盧行安，秦成，等.實時熒光PCR技術檢測肉骨粉中牛羊源性成分的方法[J].生物技術通訊，2002，13（2）：158-160.

[4] 楊寶華，宗卉.根據線粒體基因的特異性鑒別檢測飼料中的動物源性成分[J].科學試驗與研究，2000（5）：1-3.

[5] Wang Q，Zhang X，Zhang HY，et al.Identification of 12 animal species meat by T-RFLP on the 12S rRNA gene[J].Meat Science，2010，85（2）：265-269.