溫度對(duì)乙酰氨基葡萄糖發(fā)酵的影響

戴 維，秦寶福，張 銳，謝書(shū)琴

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.天方藥業(yè)有限公司，河南 駐馬店 463000)

乙酰氨基葡萄糖是氨基葡萄糖的衍生物，以其為基礎(chǔ)合成的氨基葡萄糖鹽酸鹽和硫酸鹽對(duì)于冶療關(guān)節(jié)炎和胃潰瘍等疾病有良好的療效，同時(shí)還可以應(yīng)用于食品，化妝品和飼料添加劑中[1-2]。隨著經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展及人民生活水平的提高，近10年來(lái)全球出貨量基本維持在萬(wàn)噸級(jí)別以上，具有極大的市場(chǎng)潛力和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

目前生產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖的方法可分為3種：微生物發(fā)酵法、甲殼素水解法和生物轉(zhuǎn)化法[3]。制備氨基葡萄糖的傳統(tǒng)方法使用的原料是甲殼素，甲殼素是一種自然界大量存在的再生的天然生物高分子聚合物，廣泛存在于低等植物菌類、蝦、蟹、昆蟲(chóng)等甲殼動(dòng)物的外殼、真菌的細(xì)胞壁等。有文獻(xiàn)表明，有些患者對(duì)蝦蟹等海產(chǎn)品存在過(guò)敏反應(yīng)，對(duì)使用此類原材料制成的藥物也會(huì)過(guò)敏[4]。此外，傳統(tǒng)方法的原料來(lái)源(如蝦蟹殼)易受到重金屬等有害物質(zhì)的污染，進(jìn)而影響產(chǎn)品質(zhì)量。與傳統(tǒng)制備方法相比，發(fā)酵法制備氨基葡萄糖的產(chǎn)品來(lái)源于微生物，消費(fèi)者服用后不會(huì)發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)，且發(fā)酵原材料不受季節(jié)及地域條件的限制，生產(chǎn)周期短、強(qiáng)度高，對(duì)環(huán)境污染相對(duì)較小，生產(chǎn)潛力巨大。

利用重組基因大腸桿菌進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)以得到乙酰氨基葡萄糖，具有生產(chǎn)穩(wěn)定性好，且改造后加有抗生素抗性標(biāo)記，菌種不易退化，改造后的菌種生產(chǎn)氨基葡萄糖能力較強(qiáng)。試驗(yàn)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵前期溶解氧含量與工藝要求差距較大，同時(shí)在發(fā)酵中期，殘?zhí)羌肮劝彼岱e累，抑制發(fā)酵單位的增長(zhǎng)。因現(xiàn)有設(shè)備的局限性，無(wú)法滿足發(fā)酵過(guò)程中溶解氧的需求，而導(dǎo)致菌體大量死亡；為彌補(bǔ)設(shè)備不足，通過(guò)對(duì)發(fā)酵過(guò)程中控制工藝進(jìn)行調(diào)整，以減緩菌體的死亡及殘?zhí)呛凸劝彼岬姆e累。因此我們嘗試通過(guò)適當(dāng)降低溫度達(dá)到減緩菌體的生長(zhǎng)速率、減少氧的消耗量從而增加溶氧量[5-6]，同時(shí)緩解低溶氧水平下殘?zhí)呛凸劝彼岱e累對(duì)生產(chǎn)菌產(chǎn)物合成造成的不利影響。本文旨在考察在乙酰氨基葡萄糖發(fā)酵過(guò)程的不同階段，采用不同培養(yǎng)溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響，以此確立乙酰氨基葡萄糖不同階段的最佳培養(yǎng)溫度，最終采用變溫培養(yǎng)的方法提高乙酰氨基葡萄中試發(fā)酵試驗(yàn)的生產(chǎn)水平。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

Dg021(天方藥業(yè)有限公司提供)。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：磷酸二氫鉀10，磷酸氫二鉀8，硫酸鎂0.3，七水合硫酸亞鐵0.005，七水合硫酸鋅0.005，一水合硫酸錳0.003，五水合硫酸銅0.003，二水合檸檬酸三鈉2，二水合氯化鈣0.15，泡敵0.15。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：磷酸二氫鉀10，磷酸氫二鉀15，硫酸鎂3，七水合硫酸亞鐵0.05，七水合硫酸鋅0.05，一水合硫酸錳0.03，五水合硫酸銅0.03，一水合檸檬酸2，二水合氯化鈣1.5，泡敵0.15。

1.2 培養(yǎng)方法

1.2.1 種子罐

36.5±1℃培養(yǎng)，罐壓0.03MPa，風(fēng)量1∶1，接種后全程開(kāi)啟攪拌。

1.2.2 發(fā)酵罐

36.5±1℃培養(yǎng)，罐壓0.03MPa，起始風(fēng)量1∶1，接種后全程開(kāi)啟攪拌，發(fā)酵過(guò)程中根據(jù)溶氧情況調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速。

1.3 檢測(cè)手段

1.3.1 乙酰氨基葡萄糖含量測(cè)定

HPLC法[7]。

1.3.2 氨基氮的檢測(cè)

甲醛滴定法[8]。

1.3.3 OD600 測(cè)定

OD值在0.3～0.7取發(fā)酵液直接在分光光度計(jì)600nm處，純水做對(duì)照對(duì)數(shù)即OD值；OD值1以上根據(jù)濃度稀釋，確保吸光值落在0.3～0.7之間，600nm讀數(shù)，數(shù)值乘以稀釋倍數(shù)即OD值。

1.3.4 發(fā)酵液中葡萄糖及谷氨酸檢測(cè)

SBA-生物傳感分析儀，標(biāo)準(zhǔn)液標(biāo)定，待路燈顯示進(jìn)樣，取發(fā)酵液20000r/min離心2min上清液25μL，進(jìn)樣，直接讀出葡萄糖與谷氨酸的濃度；如果數(shù)值超過(guò)100則需稀釋。

2 結(jié)果與討論

在氨基葡萄糖的發(fā)酵中，原有的工藝溫度控制范圍為36.5±1℃，發(fā)酵9小時(shí)左右OD值為23～30時(shí)添加誘導(dǎo)劑。試驗(yàn)采用了逐步降溫的方法來(lái)考察溫度對(duì)氨糖發(fā)酵的影響，共進(jìn)行了五個(gè)梯度的試驗(yàn)，如表1所示。

表1 各組中試發(fā)酵試驗(yàn)的培養(yǎng)溫度Table 1 The culture temperature of the pilot fermentation test in each group

2.1 降溫對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)的影響

發(fā)酵19h 、36.5±1℃培養(yǎng)，19h后36±1℃培養(yǎng)(對(duì)照)與誘導(dǎo)前36.5±1℃，誘導(dǎo)后36±1℃，23h 35±1℃培養(yǎng)(試驗(yàn)1)對(duì)氨糖發(fā)酵各項(xiàng)指標(biāo)的影響，如表2所示。

表2 降溫培養(yǎng)后對(duì)照與試驗(yàn)1各項(xiàng)指標(biāo)的對(duì)比Table 2 Comparison of Control and Test 1 Indicators after Cooling Culture

在氨糖發(fā)酵的工藝控制中，殘?zhí)呛凸劝彼岱謩e達(dá)到10 mg/100mL以上即超過(guò)工藝要求值，殘?zhí)呛凸劝彼岽罅糠e累后會(huì)影響氨糖單位的增長(zhǎng)。從表2中可以看出降溫前，發(fā)酵罐30h以后谷氨酸開(kāi)始積累，47h殘?zhí)欠e累，此時(shí)單位增長(zhǎng)停滯，至54h單位倒長(zhǎng)；誘導(dǎo)后降溫培養(yǎng)發(fā)酵罐在41h谷氨酸開(kāi)始積累，54h殘?zhí)浅霈F(xiàn)積累現(xiàn)象，單位增長(zhǎng)較對(duì)照組有明顯好轉(zhuǎn)。我們可以看出在氨糖發(fā)酵中采用降溫培養(yǎng)對(duì)單位的提高有明顯的改善，因此在試驗(yàn)中繼續(xù)降低發(fā)酵過(guò)程中的溫度。

2.2 谷氨酸的變化趨勢(shì)

誘導(dǎo)前36.5±1℃，誘導(dǎo)后35±1℃培養(yǎng)(試驗(yàn)2)與誘導(dǎo)前35±1℃，誘導(dǎo)后34±1℃培養(yǎng)(試驗(yàn)3)。在試驗(yàn)2和試驗(yàn)3中殘?zhí)蔷捶e累，其谷氨酸濃度對(duì)比見(jiàn)圖1，單位指標(biāo)對(duì)比見(jiàn)圖2。

圖1 試驗(yàn)2和試驗(yàn)3谷氨酸濃度對(duì)比

圖2 試驗(yàn)2和試驗(yàn)3單位指標(biāo)對(duì)比

由圖1及表2可以看出試驗(yàn)2，試驗(yàn)3同試驗(yàn)1相比谷氨酸濃度要低，試驗(yàn)3在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中谷氨酸未發(fā)生積累現(xiàn)象；從整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中的單位增長(zhǎng)趨勢(shì)來(lái)看試驗(yàn)2和試驗(yàn)3也較試驗(yàn)1要高。由圖2可以看出雖然試驗(yàn)3相較試驗(yàn)2起步單位要低但是在發(fā)酵后期試驗(yàn)2出現(xiàn)倒長(zhǎng)現(xiàn)象，而試驗(yàn)3一直保持著穩(wěn)定的增長(zhǎng)。從試驗(yàn)1到試驗(yàn)3我們可以看出在中試試驗(yàn)中較低的培養(yǎng)溫度對(duì)氨基葡萄糖發(fā)酵單位的增長(zhǎng)有積極的作用，因此再接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)進(jìn)行低溫試驗(yàn)。

2.3 誘導(dǎo)前后溫度變化對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)的影響

移種后整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中33±1℃培養(yǎng)(試驗(yàn)4)與誘導(dǎo)前36.5±1℃，誘導(dǎo)后33±1℃培養(yǎng)(試驗(yàn)5)。

表3 試驗(yàn)4和試驗(yàn)5的各項(xiàng)指標(biāo)對(duì)比

由表3可以看出試驗(yàn)4和試驗(yàn)5谷氨酸和殘?zhí)侨袒緹o(wú)積累，且整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中單位一直在穩(wěn)定增長(zhǎng)。最終放罐單位相比前三個(gè)試驗(yàn)要高出18%以上。但是試驗(yàn)4由于發(fā)酵全程一直是33±1℃培養(yǎng)，菌體生長(zhǎng)較慢造成誘導(dǎo)時(shí)間比試驗(yàn)5晚兩個(gè)小時(shí)以上，且起步單位要低。試驗(yàn)5誘導(dǎo)后33±1℃培養(yǎng)，殘?zhí)羌肮劝彼釠](méi)有發(fā)生積累，其最終放罐單位比試驗(yàn)4高。因此在以后的中試試驗(yàn)中我們確立了誘導(dǎo)前36.5±1℃，誘導(dǎo)后33±1℃培養(yǎng)的工藝路線。

3 結(jié)論

在我們進(jìn)行氨糖中試發(fā)酵試驗(yàn)過(guò)程中，由于現(xiàn)有的中試設(shè)備限制溶氧條件不能滿足氨糖發(fā)酵過(guò)程中菌體的生長(zhǎng)，我們通過(guò)更改補(bǔ)糖計(jì)量罐，調(diào)整攪拌裝置，提高通風(fēng)量等一系列措施下仍不能滿足菌體對(duì)溶氧的需求，于是我們采用降低培養(yǎng)溫度來(lái)增加發(fā)酵過(guò)程中的溶解氧。經(jīng)過(guò)大量的試驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)不但發(fā)酵溶氧水平相較以前有了明顯改善，殘?zhí)呛凸劝彼岱e累現(xiàn)象也得到了改善，氨糖發(fā)酵單位由最初的20 g/L左右提高到最高90g/L，并在之后的試驗(yàn)中平均單位穩(wěn)定在75 g/L左右。出現(xiàn)這種情況的原因是，通過(guò)降低溫培養(yǎng)度，減緩了菌體的生長(zhǎng)速率、減少了氧的消耗，從而使溶氧達(dá)到工藝要求值。另一原因是氨糖發(fā)酵使用的是較稀薄的培養(yǎng)基，在較低的培養(yǎng)溫度下，菌體生長(zhǎng)放緩，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝減慢，利于延長(zhǎng)發(fā)酵周期，提高產(chǎn)量。最終我們確定了誘導(dǎo)前36.5±1℃，誘導(dǎo)后33±1℃培養(yǎng)的工藝路線，雖然此工藝路線是在設(shè)備受限的情況下得出，但是我們?cè)谠囼?yàn)中發(fā)現(xiàn)降溫培養(yǎng)對(duì)氨糖發(fā)酵過(guò)程中抑制谷氨酸、殘?zhí)堑姆e累以及延長(zhǎng)發(fā)酵周期從而提高銨糖產(chǎn)量有明顯作用，這對(duì)于今后氨糖大規(guī)模生產(chǎn)中的工藝控制有很強(qiáng)的指導(dǎo)意義。

[1] Sachadyn P,Jedrzejczak R,Milewski S,et al.Purification to homogeneity of Candida albicans glucosamine-6-phosphate synthase overexpressed in Escherichia coli[J].Protein Expres Purif,2000,19(3)：343-349.

[2] 王升等.利用發(fā)酵法生產(chǎn)氨基葡萄糖的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通,2014(1):68-74.

[3] 劉佃磊， 李丕武， 李瑞瑞，等.高產(chǎn)氨基葡萄糖基因工程菌的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通,2014,22(3):36-41.

[4] Mojarrad J S,Nemati M,Valizadeh H,et al.Preparation of glucosamine from exoskeleton of shrimp and predicting production yield by response surface methodology[J].J Agric Food Chem， 2007，55:2246-2250.

[5] 何建勇.發(fā)酵工藝學(xué)[M].2版.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2009，141.

[6] 康立宏，姜 帆.變溫培養(yǎng)對(duì)青霉素發(fā)酵的影響[J].黑龍江醫(yī)藥，2000，5:269-271 2000,13(5):269-270.

[7] 李 璟，李志偉， 王立峰.HPLC法測(cè)定鹽酸氨基葡萄糖口腔崩解片中鹽酸氨基葡萄糖的含量[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2010，31(1):69-71.

[8] Koteva K P，Cantin A M，Neugebauer W A，et al．Synthesis and evaluation of novel β-lactam inhibitors of human leukocyte dlastase[J]．Can J Chem，2001，79(4)：377-387．