枸杞離體快速繁殖技術研究及蛋白質含量測定

李梓欣，孫 萌，何 橙，李亞男，晉一帆,孫志藝

(山東中醫藥大學 藥學院，山東 濟南 250000)

枸杞為茄科，枸杞屬多年生落葉灌木，在世界范圍內約有80多個種，是一個世界分布屬[1]，我國枸杞有7個品種，3個變種，多數分布在我國的西北和華北地區。枸杞是我國傳統的“藥食同源”[2]的中藥材之一，在《神農本草經》、《本草綱目》中均有記載，具有軟化血管、降低膽固醇、祛風明目、潤肝清肺[3]等功效。現代藥理學研究發現枸杞嫩莖葉富含甜菜堿、蘆丁以及多種人體所需的氨基酸、多糖以及微量元素等。隨著當今經濟快速發展以及越來越多人注重保健和養生，枸杞這類既有醫療保健作用又有豐富的營養價值的“中藥蔬菜”[4]已成為時代發展的需要，目前食用的枸杞主要來源于野生采集和人工栽培，但是野生資源有限，人工種植生產周期長、占地面積大，因此對枸杞種植提出了更高的要求。杜國利[5]等人通過實驗得出以大量元素培養基為基本培養基，采用不同濃度的激素配比，優化了枸杞繁殖的再生條件；唐曉杰[6]等人通過對寧夏枸杞的種子進行快速繁殖技術研究，得出枸杞最適宜的初代培養基為MS+BA0.2mg/L+6-BA1.5mg/L；目前對于枸杞多糖成分的研究和報道較多，對蛋白質含量測定的研究較少，衛彬頡[7]通過對栽培枸杞與野生枸杞進行營養成分分析，發現栽培枸杞蛋白質、總糖、VC等含量明顯高于野生枸杞，本研究旨在通過快速繁殖技術，探討培養基類型、植物激素類型等影響因素對培養結果的影響，優化枸杞快速繁殖體系，提高枸杞繁殖速率，優化野生枸杞與栽培枸杞蛋白質含量分析內容，為今后對枸杞快速繁殖和營養成分研究提供借鑒。

1 材料、儀器與試劑

1.1 材料

試驗材料采自山東中醫藥大學藥圃中。

1.2 儀器

超凈工作臺(上海康路儀器設備有限公司)，高溫蒸汽滅菌鍋(SANYO, MLS-3780 )，超純水系統(Mili-Q )，電子分析天平(FA2004，上海良平儀器儀表有限公司)；PH計(Sartorius PB-10,北京賽多利斯科學儀器有限公司；超聲震蕩儀(KQ2200，昆山市超聲儀器有限公司)；臺式高速冷凍離心機(H-1850R，長沙湘儀離心機儀器有限公司)；紫外可見分光光度計(UV-3010，日本日立公司)電熱鼓風干燥箱，電子天平，培養瓶若干，微量移液器，100mL、10mL量筒若干，500mL、1000 mL燒杯若干，培養皿，錐形瓶等。

1.3 試劑

無水乙醇(分析純)(天津市富宇精細化工有限公司)、現配0.1%升汞、無菌水、蔗糖(國藥集團化學試劑有限公司)、瓊脂粉(北京奧博星生物技術有限公司)、6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)(濟南圣和化工有限公司)、NAA(α-萘乙酸)(濟南圣和化工有限公司)、純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)；Tris(Amresco,93349)；1M HCl；蔗糖；考馬斯亮藍(G250)；NaOH(分析純)；牛血清蛋白(Amresco)

2 方法

2.1 組培處理方法

采摘新鮮枸杞，將葉片摘下，并將嫩莖剪成帶4～5個腋芽的小段，用毛刷蘸取少量用水稀釋的洗衣粉將其表面的雜質清洗干凈，分別將葉片與嫩莖段放入盛有自來水的燒杯中浸泡3～5min，后用流動的自來水沖洗3～5次，在超凈操作臺內進行消毒：分別用75%的酒精浸泡(20、30、40s)，用無菌水搖洗1～2次，再用0.1%HgCl2溶液分別消毒(6、8、10min)，然后用無菌水沖洗4～5次，在無菌培養基上切成含有1～2個腋芽[8]的小段，分別接種在含有0.8g/L的瓊脂和30g/L的蔗糖，pH控制在5.7～5.8，添加不同植物激素濃度的培養基中，在每個培養基中分別接種4～5個外植體，接種完畢后放于植物組織培養室中，溫度保持在23～25 ℃，光強2200 lx，光照周期12h/24h。

2.2 溶液的配置和蛋白質提取

2.2.1 試劑配置

濃縮膠緩沖液：精密稱取Tris5.98g和1M HCl48.0mL溶解，調節溶液pH至6.7，定容至100mL，過濾，4℃儲存備用。

考馬斯亮藍G250溶液：精密稱取考馬斯亮藍G250 100mg，加入95%乙醇50mL，超聲溶解，溶液顯藍色，待考馬斯亮藍溶解后再加入85%磷酸溶液120mL攪拌，溶液呈血紅色，最后用純凈水定容至1000mL，溶液呈褐色，超聲4h，用定量濾紙過濾，備用。

蛋白質標準溶液：精密稱取10mg牛血清蛋白，用少量純凈水溶解，定容至100mL，配置成0.1mg/mL的蛋白質標準母液。分別吸取母液1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL分別定容至10mL，配置成0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.03mg/mL、0.04mg/mL、0.05mg/mL、0.06mg/mL、0.07mg/mL、0.08mg/mL、0.09mg/mL、0.10mg/mL的蛋白質標準溶液，4℃儲存備用。

2.2.2 堿法提取蛋白質

稱取野生枸杞葉和栽培枸杞葉干粉各1.0g，按照1∶70(g/mL)的比例加入提取劑(NaOH溶液，最佳濃度為0.1～0.2mol/L)，在45℃下振蕩浸提，后用4000r/min離心20min，吸取上清液用于測定水溶性蛋白質含量，4℃儲存備用。

2.3 統計公式

誘導率(%)=(生成芽數/接種數)×100%

污染率(%)=(污染鱗片數/接種鱗片數)×100%

精密吸取待測溶液1mL，加入5mL考馬斯亮藍顯色5min，在595nm處測定其吸光度，平行測定三次。計算總蛋白質含量(%)=CD/W*100

C——供試品中蛋白質含量,mg;

D——供試品的稀釋因子;

W——供試品質量。

3 結果與分析

3.3.1 誘導培養基

3.1.1 外植體的選擇

表1 不同外置體及放置方式對誘導率的影響

圖1 嫩葉

由表1可知，外植體的選材部位及放置方式對誘導效果有很大的影響，其中選取枸杞嫩莖并將形態學下端沒入培養基的培養方式誘導率最高(見圖1與圖2)，為86.67%，嫩葉的誘導率遠遠小于嫩莖。結果表明枸杞嫩莖具有較大的器官發生潛能[9]，因此，枸杞嫩莖為最佳外植體，以將形態學下端沒入培養基中的方式接種。

圖2 嫩莖

3.1.2 消毒滅菌時間

表2 消毒滅菌時間對枸杞嫩莖誘導的影響

表2(續)

由表2可知，消毒時間不同，枸杞的誘導情況不同。消毒時間不夠培養基容易受到污染且誘導率不高，消毒時間延長可以降低污染率，但由于消毒時間過長導致細胞活性降低，對誘導率有很大影響，整體來看，最佳的消毒時間為75%酒精30 s+0.1%升汞8 min，其污染率為26.67%，誘導率為86.67%。

3.1.3 植物激素濃度

表3 不同激素配比對枸杞嫩莖誘導的影響

由表3可知，植物生長調節劑[4]的濃度配比很大程度上影響了外植體形成愈傷組織的誘導率，6-BA比NAA更容易促進細胞分裂形成愈傷組織，6-BA與NAA適當的配比可以提高外植體的誘導率，激素配比為NAA0.1mg/L+6-BA1.0mg/L時誘導率最高，誘導效果最好。

3.2 繼代培養

表4 不同激素配比對不定芽增殖的影響

圖3 添加NAA的培養基

圖4 添加6-BA的培養基

由表4可知，不同激素配比對不定芽增殖有很大影響。只添加NAA的培養基可以誘導生成不定芽，不定芽少但健壯而且不易玻璃化(見圖3)，只添加6-BA的培養基誘導形成的不定芽數量多苗高但易玻璃化(見圖4)，所以，一定的激素配比可以提高不定芽的誘導率且誘導生成的不定芽苗高健壯且不易玻璃化，最佳的激素配比為NAA0.5mg/L+6-BA0.5mg/L。

3.3 生根培養

表5 不同激素配比對不定芽生根的影響

由表5可知，植物激素NAA對生根具有明顯的影響。NAA能促進生根，促進細胞分裂與擴大，誘導形成不定根，低濃度的NAA起促進作用(見圖5)，高濃度的NAA則有抑制作用(見圖6)，當激素濃度配比為NAA0.5mg/L+6-BA1.5mg/L時，生根數量最多且根系濃密，為最佳生根培養基激素配比。

圖5 低濃度的NAA

圖6 高濃度的NAA

3.4 蛋白質含量測定

表6 野生枸杞和培養枸杞蛋白質含量

對野生枸杞和培養枸杞進行蛋白質提取，分別測定其吸光度對比其蛋白質含量，見表6。通過對比發現，經過離體快速繁殖培養的枸杞中的蛋白質含量明顯高于野生枸杞中的蛋白質含量，我們可以通過離體快速繁殖技術，設定不同激素配比，增加枸杞中有效成分的含量，提高枸杞的藥用價值。

4 小結

在植物離體快速繁殖過程中，外植體的選擇和處理、植物激素的濃度配比都是影響誘導效果的重要因素。處理外植體過程中需要控制好消毒時間，由于組織培養操作過程高度要求無菌，所以要求我們提高對很多細節的把握，如滅菌后用濾紙擦干表面水分以免二次污染、及時清理長菌樣品以免對其他物品的污染，除此之外還要注意不同階段對溫度、濕度、光照的把握等。植物激素6-BA[10]具有明顯的促進細胞分裂，誘導愈傷組織的發生以及促進芽生成的作用，NAA則具有明顯的促進生根的作用，但具有低濃度促進，高濃度抑制的特點，誘導愈傷組織的最佳培養基為MS+NAA0.1mg/L+6-BA1.0mg/L，誘導不定芽的最佳培養基為MS+NAA0.5mg/L+6-BA0.5mg/L，誘導生根的最佳培基為MS+NAA0.6mg/L+6-BA1.5mg/L；通過對栽培枸杞和野生枸杞進行蛋白質含量測定，栽培枸杞的蛋白質含量明顯高于野生枸杞，通過離體快速繁殖技術，我們不僅能縮短栽培周期，還能通過特定的方法，使用特定的激素提高枸杞中營養成分的含量，增加其藥用價值，本研究將會為今后更加深入的研究提供堅實的基礎與指導。

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[5] 杜國利,宋長征,張更林.枸杞的組織培養及植株再生的條件優化[J].生物技術通訊,2006(03):384-386.

[6] 衛斌頡.野生枸杞與栽培枸杞營養成分對比分析[J].中醫臨床研究,2014,6(16):21-22.

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