虎杖苷通過p38 MAPK/Nrf2/HO-1通路減輕小鼠哮喘模型氣道炎癥

趙雨喆，姜京植，葉 晶，李 燕，李俊峰，延光海，李良昌，樸紅梅

(1. 延邊大學附屬醫院呼吸內科，吉林 延吉 133000；2. 延邊大學醫學院解剖學教研室，吉林 延吉 133002)

支氣管哮喘是一種常見的呼吸道慢性炎癥性疾病[1]。近期研究表明，氧化應激反應在哮喘的發生、發展過程中發揮重要作用[2]。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)家族重要成員之一，在哮喘發生、發展過程中發揮著不可忽視的作用。p38 MAPK受外界刺激后，磷酸化特異性底物引起生物學反應，參與調控炎癥反應及氧化應激等[3]。核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid2-related factor 2，Nrf2)作為氧化應激通路中的調節因子之一，發揮調節編碼抗氧化蛋白表達、抑制氧化應激反應等重要作用[4]。血紅素加氧酶-1(hemeoxygenase1，HO-1)基因是Nrf2的依賴基因，其產物是一種強效的抗氧化劑[5]。p38 MAPK/Nrf2/HO-1通路參與的抗氧化應激途徑，為哮喘治療的研究提供了全新方向。

中藥虎杖性味苦寒，歸肝膽肺經，具有鎮咳、平喘作用。虎杖苷(polydatin，PD)是虎杖的主要化學成分，具有止咳、平喘、祛痰、抗菌、清除自由基等作用[6]。有研究證實，虎杖苷可以通過減少肥大細胞脫顆粒等機制，減輕哮喘小鼠的氣道炎癥[7]。本研究將從抗氧化等方面探究虎杖苷對哮喘的治療作用，并探討其是否通過p38 MAPK/Nrf2/HO-1通路發揮作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 ♂BALB/c小鼠40只，體質量(20±2)g，清潔級，購自延邊大學實驗動物中心，合格證號：SCXK(吉)2011-0007。本研究得到延邊大學醫學院倫理委員會批準，在整個實驗中遵守《實驗動物管理條例》，做到減輕小鼠痛苦，增加其舒適度。

1.1.2藥物與試劑 虎杖苷、卵清蛋白(ovalbumin，OVA)、氫氧化鋁粉、β-actin抗體、雙氫羅丹明(DHR)-123試劑盒，均購自美國Sigma公司；p38 MAPK、p-p38 MAPK、HO-1、Nrf2抗體、IgG-HRP標記二抗、PCR試劑盒，均購自美國Santa Cruz公司；免疫組化試劑盒、DAB試劑盒及IgE、IL-4、IL-5、IL-13 ELISA試劑盒，均購自北京中杉金橋公司。

1.1.3儀器 霧化器(大連醫療器械廠U219)；2135型輪轉式切片機(德國徠卡公司)；分光光度計(Thermo公司)；PCR儀(美國Perkin Elmer Applied Biosystems)；酶聯免疫檢測儀RT-2100C(美國雷杜公司)；5415D型低溫高速多功能離心機(Eppendorf公司)；凝膠成像系統(Flour Chem公司)；Western blot轉膜儀(Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1動物分組及模型制備 將BALB/c小鼠隨機分為4組：生理鹽水對照組(SAL)、OVA哮喘組(OVA)、虎杖苷低、高劑量治療組(PD 30、45 mg·kg-1)，每組10只。各組小鼠適應性飼養1周后，SAL組小鼠于d 1、7、14分別腹腔注射0.2 mL生理鹽水，其余3組腹腔注射致敏液(OVA 10 μg+氫氧化鋁1 mg)0.2 mL致敏。從d 21開始，OVA組、虎杖苷低、高劑量組連續霧化激發7 d。激發液為3% OVA 10 mL，SAL組用等量生理鹽水代替。每次激發前1 h，SAL組和OVA組腹腔注射生理鹽水0.2 mL；虎杖苷低、高劑量治療組在激發前7 d開始分別腹腔注射稀釋于0.2 mL生理鹽水中的30、45 mg·kg-1的虎杖苷，每天1次，連續7 d。

1.2.2標本收集 各組小鼠最后一次霧化吸入24 h后，行無水乙醚麻醉，將麻醉后的小鼠固定在手術板上，頸部常規酒精消毒，縱行切開頸部皮膚，逐層剝離皮下組織至氣管充分暴露，在氣管上剪一小切口，插入軟管，緩慢注入4℃生理鹽水0.5 mL后回抽，反復3次，回抽量不少于0.4 mL。收集的肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)用高速冷凍臺式離心機，以3 000 r·min-1離心5 min，取上清液置于-80℃保存，離心后的沉淀物備用細胞涂片。收集BALF液后，取出小鼠左肺置于甲醛中使其固定，右肺剪碎置于-80℃環境下保存。

1.2.3肺組織學檢查 將已經固定好的小鼠左肺進行常規脫水透明、浸蠟、包埋等步驟后，將所得蠟塊切成厚度為3～5 μm的切片，并分別進行HE、PAS、Masson染色，每只小鼠隨機選3張切片，光鏡下觀察其組織學變化。

1.2.4BALF中炎癥細胞分類及計數 BALF離心后的沉淀物中加入生理鹽水，定容至200 μL，混勻后置入細胞涂片離心機，1 000 r·min-1離心10 min，再1 500 r·min-1離心5 min。涂好的細胞涂片進行Diff-Quick染色，在光學顯微鏡下進行炎癥細胞分類及計數。

1.2.5BALF中總IgE及各細胞因子含量的測定 按ELISA試劑盒說明書的步驟，檢測BALF中的總IgE及IL-4、IL-5、IL-13的含量。通過使用標準蛋白質生成的標準曲線，計算其濃度。

1.2.6檢測小鼠BALF細胞中活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量 用PBS洗BALF中的細胞并計數，使用雙氫羅丹明(DHR)-123試劑盒檢測小鼠BALF細胞中ROS水平，熒光強度(FITC)可代表ROS水平。具體方法依照試劑盒說明書進行。

1.2.7檢測小鼠BALF中的抗氧化酶和MDA 依照各個試劑盒說明書的檢測方法，檢測BALF中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)活性及丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。將保存在-80℃的BALF取出，冰上復融后，4℃、3 000 r·min-1離心10 min，分別使用試劑盒檢測小鼠BALF中SOD、CAT、MDA水平。

1.2.8免疫組化檢測肺組織中HO-1的表達 將切好的標本置于60℃烘干機內熔蠟，以增加切片的附著度。然后用二甲苯脫蠟、梯度濃度乙醇脫水，之后置于提取液內，用大功率的微波孵化15 min，緩沖液冷卻并清洗，然后用一抗、生物酶標記的二抗孵化。最后，用DAB使切片著色，蘇木精復染、脫水，用二甲苯清洗和固定。在400倍放大倍數下，隨機選擇5個不同的視野觀察。

1.2.9Western blot檢測肺組織中p-p38 MAPK、核Nrf2和HO-1表達 依照各試劑盒說明書要求，提取小鼠肺組織的總蛋白和核蛋白，將等量的蛋白(30 μg)，在10%的SDS-PAGE中以90 V恒壓電泳，切取目的條帶。300 mA低溫條件下轉膜。在脫脂奶粉封閉液中常溫封閉2 h。分別用小鼠HO-1、Nrf2、β-actin、p38 MAPK、p-p38 MAPK抗體4℃孵育過夜，將膜取出，在TBST中充分洗滌。洗膜后，加入HRP標記的相應二抗，常溫孵育1 h。將膜取出，在TBST中洗滌后，使用ECL試劑曝光。底片經掃描儀掃描后，確定目的條帶的相對吸光度值。

1.2.10Real-time PCR法檢測肺組織HO-1、Nrf2 mRNA的表達 提取總RNA，一步法逆轉錄擴增，實驗方法按Reverse Transcription Kit說明書操作。用SYBR green containing PCR Kit進行Real-time PCR。所用HO-1引物:forward 5′-GATAGAGCGCAACAAGCAGAA-3′，reverse 5′-CAGTGAGGCCCATACCAGAAG-3′；Nrf2引物：forward 5′-GGGCAAGCGACTCATGGTCAT-3′，reverse 5′-AAGCT GCATACAGTCTTCAAA-3′。實驗結果分析使用2-△△Ct法。

2 結果

2.1虎杖苷對肺組織病理學改變的影響Fig 1的肺切片HE染色顯示，與SAL組比較，OVA組氣道周圍有大量炎癥細胞浸潤。與OVA哮喘組相比，虎杖苷低、高劑量治療組炎癥細胞浸潤明顯減少，且高劑量組較低劑量組減少更加明顯。PAS染色確定虎杖苷是否抑制OVA誘導的氣道上皮的黏液分泌增多和杯狀細胞的增生，在OVA組中，PAS陽性細胞的百分比明顯高于SAL組，但這一增加明顯受到虎杖苷的抑制。Masson三聯染色驗證虎杖苷能否抑制OVA誘導的膠原蛋白沉積，在OVA哮喘組中，膠原蛋白沉積明顯較生理鹽水對照組增多，而虎杖苷治療組可抑制OVA誘導的膠原蛋白沉積。

Fig 1 Polydatin affects pathologic changes of lung tissue(×200)

2.2虎杖苷抑制哮喘小鼠BALF中總IgE、炎癥細胞總數和炎性因子水平如Fig 2所示，OVA組炎性細胞總數及總IgE濃度明顯高于SAL組，虎杖苷治療抑制了炎性細胞總數和總IgE水平的增加(P<0.05)。同時，IL-4、IL-5、IL-13的增加也被虎杖苷抑制(P<0.05)，見Fig 3。

2.3虎杖苷抑制OVA誘導的氧化應激如Tab 1所示，與生理鹽水對照組(SAL)相比，OVA哮喘組小鼠BALF中的ROS含量明顯升高(P<0.05)，同時BALF中的抗氧化酶SOD、CAT的活性明顯降低(P<0.05)，MDA含量升高(P<0.05)；虎杖苷低、高劑量治療組中的ROS含量明顯降低，SOD、CAT的活性明顯升高，MDA含量降低(P<0.05)，且高劑量組優于低劑量組。

2.4虎杖苷誘導HO-1的表達Fig 4的免疫組織化學染色結果表明，與SAL組相比，OVA組HO-1表達減少，虎杖苷治療組HO-1表達增多。

Fig 2 Polydatin reduces total number of cells (A) andIgE levels (B) in BALF n=10)

#P<0.05vsSAL;*P<0.05vsOVA

2.5虎杖苷抑制p38MAPK的磷酸化Fig 5的Western blot結果表明，OVA哮喘組p-p38 MAPK水平較生理鹽水對照組(SAL)明顯升高(P<0.05)，虎杖苷低、高劑量治療組可減少p-p38 MAPK水平的增加(P<0.05)。

Fig 3 Polydatin reduces concentration of inflammatory

#P<0.05vsSAL;*P<0.05vsOVA

2.6虎杖苷升高哮喘小鼠肺組織中HO-1的表達以及核內Nrf2蛋白的含量如Fig 6所示，相對于OVA組，虎杖苷治療組HO-1表達明顯增多(P<0.05)。且核內Nrf2蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)。

2.7虎杖苷誘導HO-1、Nrf2mRNA的表達如Fig 7所示，生理鹽水對照組(SAL)和OVA哮喘組HO-1、Nrf2的mRNA表達水平較穩定，虎杖苷低、高劑量治療組HO-1、Nrf2 mRNA表達明顯增加(P<0.05)。

3 討論

氣道炎癥細胞浸潤、炎癥細胞增多是哮喘的重要特征之一，且其程度和支氣管哮喘的嚴重程度呈明顯正相關[8]。本實驗HE染色結果表明，經虎杖苷治療的小鼠炎癥細胞浸潤程度，以及BALF中的炎癥細胞數量均明顯降低，且隨著劑量的增加療效更明顯。表明虎杖苷可以減少哮喘小鼠氣道的炎癥細胞增多以及浸潤。氣道上皮的黏液分泌增多、杯狀細胞增生和膠原沉積也是支氣管哮喘的重要特征[9]。PAS染色表明，虎杖苷可抑制OVA誘導的氣道上皮的黏液分泌增多和杯狀細胞的增生；Masson三聯染色證明虎杖苷抑制膠原沉積；同時，虎杖苷可減少哮喘小鼠的IgE。以上結果證明虎杖苷抑制OVA誘導的哮喘小鼠模型的氣道炎癥。

本研究還從氧化應激角度研究了虎杖苷的治療作用。有大量證據表明[10]， ROS在不同種類的肺損傷中發揮重要作用，大量ROS爆發破壞了體內氧化-抗氧化平衡，使機體失去正常調節功能，這與哮喘的發生、發展有著密不可分的關系?；⒄溶諟p少了BALF的ROS含量。越來越多的證據表明[11]，氧化應激與增加的脂質過氧化值有關，加重了氣道反應性，同時加重了哮喘模型中炎性介質的過度表達。在本研究中，哮喘小鼠的MDA水平明顯增加，這是脂質過氧化作用的最終產物，同時，抗氧化酶SOD和CAT活性降低，虎杖苷明顯改善了上述變化。以上結果表明，虎杖苷能減少氣道損傷，且其減輕氣道炎癥的作用可能是通過減少氧化應激實現的。

p38作為MAPK家族的重要的成員之一，受外界刺激后，磷酸化為特異性底物p-p38引起生物學效應，參與調控炎癥反應及氧化應激等[12]。本研究證明，虎杖苷可降低p38的磷酸化水平，進而減輕哮喘小鼠的炎癥反應。核轉錄因子Nrf2作為氧化應激通路的調節因子之一，發揮調節編碼抗氧化蛋白的表達、抗炎、抗損傷、抑制氧化應激反應等作用，在哮喘治療中發揮重要作用。本實驗結果發現，虎杖苷組小鼠核內Nrf2蛋白的表達明顯升高，且虎杖苷促進了Nrf2 mRNA的表達，提示虎杖苷促進了Nrf2的入核作用。應激條件下，HO-1高表達，從而表現出明顯的抗氧化作用[13]。本實驗結果可見，與OVA哮喘組相比，虎杖苷治療組的小鼠肺組織HO-1 mRNA及蛋白表達明顯增高，表明虎杖苷能誘導HO-1表達。

Tab 1 Polydatin inhibits the oxidative stress induced by n=10)

#P<0.05vsSAL;*P<0.05vsOVA

Fig 4 Polydatin induces expression of HO-1(×200)

Fig 5 Polydatin inducing phosphorylation of p38 MAPK

#P<0.05vsSAL;*P<0.05vsOVA

Fig 6 Polydatin induces expression of HO-1 at proteinlevel and induces Nrf2 into nucleus

#P<0.05vsOVA

Fig 7 Polydatin induces expression of HO-1 and Nrf2 at mRNA level

#P<0.05vsOVA

p38 MAPK/Nrf2/HO-1通路在氧化損傷途徑中發揮重要作用。p38 MAPK磷酸化是激活Nrf2的重要途徑之一，而被激活的Nrf2的核移位是HO-1活化至關重要的因素。MAPK是參與哮喘的重要信號轉導通路之一，在真核細胞內廣泛存在，激活后可促進細胞生長發育及分裂凋亡等，并參與到氧化應激反應中。綜上所述，本實驗結果證實，在OVA誘導的哮喘小鼠模型中，虎杖苷通過激活p38 MAPK/Nrf2信號通路，提高HO-1 mRNA的轉錄水平，增強HO-1蛋白表達，從而發揮了抗氧化損傷作用，改善了哮喘小鼠的氣道炎癥。

(致謝：本實驗在延邊大學過敏性疾病研究室完成，感謝各位老師和同學給予的指導和幫助！)

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