血小板-白細(xì)胞聚集體促進(jìn)大鼠心肌缺血再灌注損傷及缺血后適應(yīng)的保護(hù)作用

孫靜，任法新，孫曉健，張傳煥，李留東，牟楠，董梅△

再灌注治療是挽救缺血心肌的有效治療措施，但在恢復(fù)血流灌注之后，缺血心肌的損傷反而會(huì)加重，這一現(xiàn)象被稱之為心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）。研究表明，MIRI是導(dǎo)致心肌缺血患者術(shù)后心功能障礙的主要病因［1］。深入研究MIRI病理機(jī)制，探索保護(hù)心肌的新靶點(diǎn)及藥物是目前臨床面臨的重大挑戰(zhàn)之一。c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）是促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）超家族的成員之一，其是MAPK信號(hào)通路的一種，P-JNK是JNK信號(hào)通路的中間產(chǎn)物，通過(guò)檢測(cè)P-JNK能夠間接地反應(yīng)JNK信號(hào)通路的活性。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，JNK信號(hào)通路與組織缺血再灌注損傷關(guān)系密切，組織缺血再灌注損傷常伴隨著JNK表達(dá)的變化，且多數(shù)研究提示缺血再灌注損傷可增加JNK信號(hào)通路的活性［2-3］。血小板-白細(xì)胞聚集體（platelet-leukocyte aggregates，PLA）是活化的血小板與白細(xì)胞相互作用形成的聚集體，被認(rèn)為是一個(gè)反映血栓負(fù)荷及炎癥反應(yīng)的敏感指標(biāo)［4］。PLA水平升高與急性心肌梗死（AMI）患者近遠(yuǎn)期臨床預(yù)后不佳密切相關(guān)［5］。本課題組前期研究證實(shí)，PLA是AMI發(fā)生的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，缺血后適應(yīng)（ischemic postconditioning，PostC）可以顯著減輕MIRI，減少心肌梗死面積，是重要的心臟保護(hù)措施［6］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠心肌缺血再灌注模型，觀察PostC及PLA在MIRI中的作用，以PostC作為干預(yù)因素，觀察其對(duì)JNK信號(hào)通路及PLA表達(dá)的影響，并探討PostC減輕MIRI與JNK信號(hào)通路及PLA的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 健康雄性SPF級(jí)SD大鼠60只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)（11400700221589），體質(zhì)量 200～250g。 SP600125和Anisomycin購(gòu)于Med Chen Express公司。肌酸激酶同工酶（CK-MB）試劑盒和肌鈣蛋白I（TnI）試劑盒購(gòu)于CUSABIO公司。紅細(xì)胞裂解液購(gòu)于BDBiosciences公司，CD45和CD41a購(gòu)于eBioscience公司。兔抗小鼠磷酸化JNK（phospho-JNK MAPK,P-JNK）多克隆抗體購(gòu)于Santa Cruz公司，相應(yīng)二抗購(gòu)自Amersham公司。

1.2 心肌缺血再灌注模型建立 大鼠每100 g體質(zhì)量給予0.23 mL的1%戊巴比妥鈉行腹腔注射麻醉，頸部正中切口，插入氣管插管以動(dòng)物呼吸機(jī)輔助呼吸。在左冠狀動(dòng)脈前降支下方穿一縫合線，通過(guò)結(jié)夾-松解前降支構(gòu)建模型。在再灌注5 min后，通過(guò)右頸靜脈根據(jù)分組注射不同藥物，處理結(jié)束后通過(guò)頸動(dòng)脈插管抽取血3～4 mL用于后續(xù)指標(biāo)檢測(cè)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與干預(yù) 隨機(jī)數(shù)字表法將實(shí)驗(yàn)大鼠分為6組，每組10只。（1）假手術(shù)（Sham）組：開(kāi)胸，分離左冠狀動(dòng)脈并穿線，但不結(jié)扎，曠置30 min，缺血25 min時(shí)通過(guò)右頸靜脈注射10%二甲基亞砜（DMSO）0.8 mL。（2）缺血再灌注（I/R）組：缺血25 min通過(guò)右頸靜脈注射10%DMSO 0.8 mL，缺血結(jié)束后恢復(fù)持續(xù)再灌注3 h。（3）后適應(yīng)（PostC）組：缺血25 min時(shí)通過(guò)右頸靜脈注射10%DMSO 0.8 mL，缺血結(jié)束后、再灌注前通過(guò)結(jié)夾-松解冠脈實(shí)現(xiàn)1 min再灌注和1 min缺血反復(fù)3次后，持續(xù)再灌注3 h。（4）SP600125（I-JNK）組：缺血25 min時(shí)通過(guò)右頸靜脈注射SP600125（6 mg/kg，溶于10%DMSO 0.8 mL），缺 血 結(jié) 束 后 持 續(xù) 再 灌 注 3 h。（5）JNK 激 動(dòng) 劑（Anisomycin）+后適應(yīng)（Ani+PostC）組：缺血25 min時(shí)通過(guò)右頸靜脈注射Anisomycin（2 mg/kg，溶于10%DMSO 0.8 mL），缺血結(jié)束后再灌注前通過(guò)結(jié)夾-松解冠脈實(shí)現(xiàn)1 min再灌注和1 min缺血反復(fù)3次后，持續(xù)再灌注3 h。（6）Anisomycin（Ani）組：缺血25 min時(shí)通過(guò)右頸靜脈注射Anisomycin（2 mg/kg，溶于10%DMSO 0.8 mL），缺血結(jié)束后持續(xù)再灌注3 h。

1.4 心肌損傷標(biāo)志物的測(cè)定 利用試劑盒測(cè)定CK-MB和TnI水平。所有操作根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行。

1.5 心肌梗死面積的測(cè)定 再灌注3 h后取出心臟，置于-20℃冰箱約20 min，冷凍后按垂直于左心室長(zhǎng)軸方向切片（厚約2 mm）。將新鮮組織切片置于裝有1%2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液中孵育15 min（pH 7.4，37℃）。使用TTC染色后，梗死區(qū)心肌呈現(xiàn)蒼白色，而活性心肌呈現(xiàn)紅色。心肌梗死面積以梗死區(qū)與左室總體積的比值來(lái)表示。

1.6 PLA的測(cè)定 抽血時(shí)棄去前2 mL血，獲取枸櫞酸鈉抗凝全血標(biāo)本，立即處理。參見(jiàn)文獻(xiàn)［7］采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)基礎(chǔ)狀態(tài)、缺血30 min、再灌注30 min、再灌注60 min及再灌注3 h PLA表達(dá)水平。

1.7 Western blot法測(cè)定P-JNK水平 再灌注3 h后取出心臟，-80℃冰箱冷凍，參見(jiàn)文獻(xiàn)［8］提取心肌組織總蛋白。抗原抗體復(fù)合物用ECL法顯示，暗室X線膠片曝光，采用Image-Pro Plus圖像分析軟件分析蛋白條帶的積分光密度值（integrated optical density，IOD），IOD=平均光密度值×面積，以靶蛋白IOD值/β-actin IOD值的比值反映靶蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間各指標(biāo)比較分別采用兩獨(dú)立樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)、單因素方差分析和析因設(shè)計(jì)方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)；重復(fù)測(cè)量資料PLA表達(dá)水平采用重復(fù)測(cè)量方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組心肌損傷標(biāo)志物比較 與Sham組相比，I/R組CK-MB和TnI水平明顯升高（P＜0.05）；與I/R組相比，PostC組和I-JNK組CK-MB和TnI水平降低（P＜0.05）；與PostC組相比，Ani+PostC組和Ani組CK-MB和TnI水平明顯升高（P＜0.05），見(jiàn)表1、2。

2.2 各組心肌梗死面積比較 與Sham組相比，I/R組心肌梗死面積顯著增加（P＜0.05）；與I/R組相比，PostC組和I-JNK組梗死面積減小（P＜0.05）；與PostC組相比，Ani+PostC組和Ani組梗死面積增加（P＜0.05），見(jiàn)表1、2，圖1。

Tab.1 Serum markers and infarct areas in six groups表1 各組心肌損傷標(biāo)志物及梗死面積（n=10，±s）

Tab.1 Serum markers and infarct areas in six groups表1 各組心肌損傷標(biāo)志物及梗死面積（n=10，±s）

組別Sham組I/R組PostC組I-JNK組Ani組Ani+PostC組CK-MB（pg/L）166.02±33.26 637.31±43.99 257.38±53.12 402.10±47.94 638.34±25.87 500.84±52.93 TnI（pg/L）7.79±0.54 19.67±0.66 10.05±0.81 14.26±1.31 19.96±0.72 17.32±0.77梗死面積（%）0 40.17±1.77 16.68±2.06 24.62±1.58 40.62±1.59 27.91±1.79

Fig.1 Infarct areasafter cardiac I/Rinjury in six groups圖1 各組心肌梗死面積

2.3 各組PLA的表達(dá)水平比較 隨灌注時(shí)間延長(zhǎng)，I/R組、Ani+PostC組及Ani組PLA表達(dá)水平逐漸上升，PostC組和I-JNK組PLA表達(dá)水平先上升后在再灌注60 min和3 h時(shí)呈下降趨勢(shì)。I/R組的PLA表達(dá)水平在缺血后和再灌注時(shí)高于Sham組。在再灌注60 min和3 h，PostC組和I-JNK組PLA表達(dá)水平低于I/R組。Ani+PostC組和Ani組PLA表達(dá)水平明顯高于PostC組，見(jiàn)表3、4。

Tab.3 PLA expression levelsat different timepointsin six groups表3 各組PLA表達(dá)水平 （n=10，%，±s）

組別Sham組I/R組PostC組I-JNK組Ani組Ani+PostC組基礎(chǔ)狀態(tài)7.96±0.30 8.06±0.23 9.01±0.26 8.43±0.22 9.23±0.40 9.30±0.29缺血30 min 8.70±0.56 23.70±2.79 22.76±1.93 23.90±2.06 22.20±2.82 21.81±2.14再灌注30 min 8.99±0.56 34.78±2.79 32.50±1.93 32.90±2.06 32.7±2.82 32.69±2.14再灌注60 min 8.80±0.36 42.00±2.02 23.90±0.89 29.57±1.46 45.70±1.69 45.66±0.94再灌注3 h 10.11±0.87 51.03±2.02 18.40±1.27 26.64±1.18 54.80±1.40 54.35±1.45

2.4 各組P-JNK的表達(dá)水平比較 再灌注3 h后，Sham組、I/R組、PostC組、I-JNK組、Ani+PostC組和Ani組的P-JNK IOD值分別為0.26±0.06、0.80±0.09、0.48±0.05、0.74±0.04、0.70±0.06和0.87±0.04。I/R組P-JNK水平高于Sham組（t=5.418，P=0.006）；PostC組和I-JNK組P-JNK水平低于I/R組（F=8.166，P=0.019）；I/R組、PostC組、Ani組、Ani+PostC組P-JNK水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（FPostC=21.398，P=0.002；FAni=5.349，P=0.049；FAni+PostC=0.301，P=0.598），PostC和IJNK抑制了P-JNK的生成，而Ani促進(jìn)P-JNK水平升高，Ani+PostC組和Ani組P-JNK水平明顯升高于PostC組，見(jiàn)圖2。

Fig.2 P-JNK expression in all groups圖2 各組P-JNK表達(dá)水平

3 討論

炎癥是MIRI發(fā)生的重要機(jī)制之一。在這個(gè)過(guò)程中，大量的白細(xì)胞和血小板被激活，白細(xì)胞P-選擇素糖蛋白配基-1（PSGL-1）與血小板表達(dá)的P-選擇素相互作用形成PLA。而PLA是反映體內(nèi)血栓負(fù)荷及炎癥反應(yīng)的敏感指標(biāo)［4］。新近研究發(fā)現(xiàn)，高水平PLA與急性冠狀動(dòng)脈綜合征發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)［9］，是非ST段抬高型心肌梗死預(yù)后不良的標(biāo)志物［5］。筆者課題組前期研究已證實(shí)，在ST段抬高型心肌梗死患者中，高水平的PLA不僅可以作為急性心肌梗死的一個(gè)新的預(yù)測(cè)指標(biāo)［6］，而且發(fā)現(xiàn)其水平與心肌無(wú)復(fù)流的發(fā)生率呈正相關(guān)［10］。

PostC是近年發(fā)現(xiàn)的機(jī)體內(nèi)重要內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)。大量研究已經(jīng)證實(shí)，PostC可通過(guò)減少心肌梗死面積［11］、減輕梗死后心律失常程度［12］、改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能［7］和心肌收縮功能［13］，從而發(fā)揮心臟保護(hù)作用。作為心臟重要的保護(hù)措施，PostC能夠減輕MIRI，改善心功能，但具體機(jī)制還不是很明確。在大鼠MIRI模型中，JNK抑制劑AS601245可以顯著減少心肌細(xì)胞的凋亡，減少心肌梗死面積［14］。另有研究證實(shí)，JNK與MIRI表達(dá)水平具有高度的相關(guān)性［2-3］。這些研究提示可以通過(guò)調(diào)節(jié)JNK信號(hào)通路尋找減輕MIRI的新的靶點(diǎn)。

本研究顯示，（1）與Sham組比較，I/R組CKMB、TnI水平明顯升高，梗死面積明顯擴(kuò)大，證實(shí)MIRI具有顯著的心肌損害作用。在大鼠MIRI的不同時(shí)間點(diǎn)，I/R組PLA的表達(dá)水平逐漸上升，去除時(shí)間因素，與Sham組比較，I/R組的PLA表達(dá)水平顯著升高，提示炎癥血栓標(biāo)志物PLA參與MIRI發(fā)生機(jī)制。在再灌注3 h，與Sham組比較，I/R組P-JNK表達(dá)水平明顯升高，提示大鼠MIRI可以激活JNK信號(hào)通路，促進(jìn)P-JNK表達(dá)。（2）與I/R組相比，PostC組和I-JNK組CK-MB、TnI水平降低和梗死面積減小；在再灌注60 min和3 h，PostC組和I-JNK組PLA表達(dá)水平明顯降低；在再灌注3 h，PostC組和I-JNK組明顯抑制了P-JNK的生成。這些結(jié)果說(shuō)明PostC和JNK抑制劑能夠顯著減少CK-MB和TnI水平，縮小心肌梗死面積，提示PostC與JNK抑制劑具有類似的心臟保護(hù)作用，而且PostC與JNK抑制劑均能夠顯著減少PLA和P-JNK表達(dá)水平，提示JNK信號(hào)通路的抑制能夠降低PLA的表達(dá)，PostC發(fā)揮心臟保護(hù)作用與抑制炎癥血栓標(biāo)志物PLA的表達(dá)、抑制JNK信號(hào)通路的活性有關(guān)。（3）與PostC組相比，Ani+PostC組和Ani組CK-MB、TnI水平升高且梗死面積明顯增加；由此可見(jiàn)，因?yàn)镴NK激動(dòng)劑Anisomycin的應(yīng)用，PostC聯(lián)合Anisomycin激活劑可部分抵消PostC的保護(hù)效應(yīng)，進(jìn)一步說(shuō)明PostC通過(guò)抑制JNK信號(hào)通路、降低JNK的表達(dá)來(lái)減輕MIRI，進(jìn)而發(fā)揮心臟保護(hù)作用。與PostC組相比，再灌注60 min和3 h，Ani+PostC組和Ani組PLA表達(dá)水平明顯升高，Anisomycin部分抵消了PostC對(duì)PLA表達(dá)的抑制作用，表明JNK信號(hào)通路的激活能夠促進(jìn)PLA的表達(dá)，PostC可能通過(guò)抑制JNK信號(hào)通路活性而減少PLA的表達(dá)，從而減輕MIRI，發(fā)揮心臟保護(hù)作用。

MIRI的發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，目前關(guān)于MIRI機(jī)制的研究越來(lái)越關(guān)注心肌的炎癥反應(yīng)。局部過(guò)度炎癥反應(yīng)是造成MIRI主要原因之一。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了JNK信號(hào)通路與MIRI炎癥血栓標(biāo)志物PLA表達(dá)水平密切相關(guān)。與JNK抑制劑作用一致，PostC可抑制JNK途徑的激活，減少PLA表達(dá)水平，減輕MIRI。因此，通過(guò)藥物等外界手段抑制MIRI過(guò)程中的炎癥反應(yīng)，減少梗死面積，改善心功能，可能為減輕MIRI提供一條新的有效途徑。

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