一株耐高乙醇和低pH己酸產生菌Lysinibacillus fusiformispBE3-ep-SigB的構建

薛正楷，楊根慶，張宿義，倪 斌，5

（1.瀘州職業技術學院 白酒學院，四川 瀘州 646001；2.瀘州市生物醫學工程研究所，四川 瀘州 646000；3.新鄉醫學院第三附屬醫院檢驗科，河南 新鄉 453003；4.瀘州老窖股份有限責任公司，四川 瀘州 646002；5.瀘州江潭窖酒業有限公司，四川 瀘州 646005）

目前，中國白酒有12種香型，其中濃香型白酒以其芳香濃郁、綿柔甘洌、香味協調、入口甜、落口綿、尾凈余長等特點，成為中國人青睞的白酒，其年產量占中國白酒總產量的70%以上。已有研究表明，濃香型白酒的風味物質有130余種，其中己酸乙酯是濃香型白酒的主體香物質，己酸乙酯含量的高低決定著濃香型白酒品質的高低[1-3]。

己酸是己酸乙酯的風味物質前體，其來源于濃香型白酒生產過程中的窖泥微生物，梭菌屬（Clostridium）、芽孢桿菌屬（Lysinibacillus）等屬的專性厭氧微生物成為產己酸微生物的最重要類群，目前已發現的產己酸微生物包括Lysinibacillus fusiformis、Clostridium kluyveri、Lysinibacillus sphaericus、Clostridium sartagoneforme等菌株，這些菌株皆為專性厭氧微生物。

σ因子是一類啟始細菌核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）合成的蛋白質，其唯一功能是啟始特定的RNA聚合酶結合到特定環境因素誘導下的特定基因的啟動子，啟動特定基因在特定時空條件下的轉錄，以利微生物抗環境脅迫的不利影響，被其選擇表達控制的基因決定于基因的內在功能和環境信號的雙重作用。σ70因子是一類管家基因SigA基因表達的分子質量70 kDa的蛋白質，控制細胞類大多數基因的轉錄合成；σB屬于選擇性σ因子，為革蘭氏陽性菌特有的一類轉錄起始蛋白，其基因為SigB，在枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）細胞內，σB調節大量一般應激操縱子的轉錄，從而促進轉錄的200多個基因參與熱、酸、乙醇、鹽和氧化應激性[4-7]。

近年，對轉錄因子進行易錯聚合酶鏈式反應（erro-prone polymerasechainreaction，epPCR）突變篩選有義突變，成為微生物育種的重要方法。張賽等[8]運用定向進化-易錯PCR方法獲得了耐高溫和低pH的突變酶，其酶活力比野生酶分別提高了6.5倍、21.0倍和12.6倍；王睿等[9]用同樣的進化方法提高了華根霉Rhizopus chinensisCCTCC M201021的脂肪酶活力，其最佳突變株脂肪酶酶活與野生菌株相比分別提高2倍和4倍；汪先薇[10]利用易錯PCR構建突變庫時，獲得大片段的基因簇突變庫；王聰等[11]利用實時-熒光定量-聚合酶鏈反應（real time-fluorescence quantitive-polymerase chainreaction，RT-FQ-PCR）對耐高滲基因的表達變化研究發現，T酵母能夠耐高滲是由于甘油的合成迅速同時外排通道被關閉，使得胞內甘油的含量升高，保證T酵母的正常生長；李璟等[12]采用易錯PCR方法對枯草芽孢桿菌脂肪酶基因lipaseA進行定向進化，突變株4B2發酵上清液轉化生物柴油的轉酯效率較對照菌pET 32a-lipaseA有明顯提高，前者為79.5%，后者為49.72%。

目前，己酸菌育種菌均采用窖泥分離并產酸鑒定，發酵條件優化后，直接用于生產[13-17]，并對其抗脅迫能力的研究及基因工程育種，國內外少見報道。由于產己酸微生物在窖池中伴隨糟醅的發酵過程，始終處于低pH、高乙醇濃度等高脅迫不良環境中，如何提高抗脅迫基因的表達，成為產己酸微生物生死悠關分子進化策略。為了提高產己酸菌的抗脅迫能力，因此，本研究嘗試以Lysinibacillus fusiformis為出發菌，利用易錯PCR篩選有義突變技術分別轉染SigA和SigB基因，獲得抗高乙醇和低pH脅迫的優良己酸產生工程菌，為己酸的選育提供理論依據和應用基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 質粒與菌株

穿梭質粒pBE3-MCS：由南昌大學生命科學院提供；菌株Lysinibacillusfusiformis：由本研究所分離并保存；pET32a（+）-SigA和pET32a（+）-SigB：由本研究所構建并保存。

1.1.2 培養基

LB培養基：胰蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 000 mL，調pH 7.0±0.2，固體培養基加入15 g瓊脂，121℃滅菌30 min。

改良麥氏培養基：葡萄糖1.0 g，KCl 1.8 g，酵母膏4 g，醋酸鈉15 g，固體培養基加入瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然，121℃滅菌30 min，使用前加入20 mL無水乙醇。

乙酸鈉培養基：葡萄糖1.0 g，KCl 1.8 g，酵母膏2.5 g，醋酸鈉8.2 g，固體培養基加入瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然，121℃滅菌30 min，使用前加入10 mL無水乙醇。

1.1.3 試劑

限制性核酸內切酶XbaI、HindIII、KpnI：美國Thermos Fisher Scientific公司；T4脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）連接酶、DNALigationKitVer.1（CodeNo.6021）：大連TaKaRa公司；小量質粒抽提試劑盒、普通瓊脂糖凝膠回收試劑盒（DP209）、DNA純化試劑盒、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）和DNA Marker：天根生化有限公司；易錯PCR試劑盒：天恩澤生物技術有限公司；PCR引物：由捷瑞生物工程有限公司合成；卡那霉素（分析純）：湖北信康醫藥化工有限公司；氨芐青霉素（分析純）：杭州百思生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

BSD-YF3600全溫培養搖床：上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；TGL-16M臺式高速冷凍離心機：金壇市良友儀器有限公司；WD-9413A型凝膠成像分析儀、DYY-8C電泳儀：北京市六一儀器廠；NanoDrop 2000微量紫外分光光度計：美國Bio-Rad公司；SmartSpecPlus核酸蛋白分析儀：美國伯樂公司；SC-B梯度PCR儀：杭州艾普儀器設備股份有限公司；GC-2014氣相色譜儀：日本島津公司；YQX-II厭氧培養箱：上海衡柏實驗設備有限公司；Scientz-2C基因導入儀：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 重組菌的構建篩選與引物的設計

Lysinibacillus fusiformis SigA/SigB原位超表達菌株構建按照如下流程進行。

為了從pET32a（+）-SigA和pET32a（+）-SigB重組質粒獲得目的基因SigA和SigB基因，參考pET32a（+）質粒、SigA、SigB及酶切位點基因序列，采用Primerpremier5.0軟件設計SigA和SigB基因的上下游引物，結果見表1。SigA和SigB基因的上下游引物分別帶有XbaI、HindIII和KpnI酶切位點，設計的引物由上海捷瑞生物技術公司合成。

表1 擴增SigA/SigB基因的引物設計Table 1 Design of primer sequences for amplification of SigA/SigBgene

1.3.2 pET32（+）-SigA/SigB重組質粒的提取

取E.coliBL21（DE3）/pET32a（+）-SigA/SigB，單菌落接種至5 mL含100 μg/mL氨芐青霉素LB培養基中，37℃、200 r/min振蕩培養12 h，采用天根公司質粒小提試劑盒DP103）提取質粒pET32a（+）-SigA/SigB，采用微量紫外分光光度計分別測定重組質粒濃度和波長分別為260 nm、280 nm處的吸光度值比值（A260nm/A280nm）。

1.3.3 易錯PCR條件的優化

在PCR過程中Mg2+可以穩定非互補的堿基對，而Mn2+可以降低聚合酶對模板的特異性，因而調整兩種離子的濃度，可以獲得不同突變頻率的多樣性文庫。本研究選擇Mn2+濃度為0.3～0.8mmol/L，Mg2+濃度為3～7mmol/L作為梯度進行epPCR試驗。采用數據處理系統（dataprocessingsystem，DPS）7.5對Mn2+濃度和Mg2+濃度進行2因素6水平U6（62）的均勻試驗設計，其設計方案見表2。

表2 U6(62)均勻試驗設計Table 2 U6(62)design of uniform experiments

以重組質粒pET-32a（+）-SigA/SigB為模板，按下列PCR體系和條件進行ep PCR。反應體系：10×Mix 5 μL，三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸（deoxyadenosine triphosphate，dATP）、三磷酸脫氧胸苷（deoxy-thymidine triphosphate，dTTP）、三磷酸脫氧鳥苷酸（deoxyguanosine triphosphate，dGTP）和三磷酸脫氧胞苷（deoxycytidine triphosphate，dCTP）各2.5 μL，模板1 μL，上下游引物各1 μL，Mn2+和Mg2+按表2進行添加，Taq酶2 μL，補雙蒸水至50 μL。

反應條件：SigB基因：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，45℃退火1 min，72℃延伸2 min，40個循環；72℃再延伸10 min。SigA基因：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸1.2 min，32個循環；72℃再延伸10 min。

利用1%瓊脂糖電泳確認PCR產物，采用天根膠回收試劑盒回收特異性高條件下的目的基因片段，用已回收片段為模板按第一輪ep PCR方案進行第二輪ep PCR，選取特異性高的ep PCR條件進行第二輪ep PCR，回收二輪易錯產物于-20℃備用。

1.3.4SigA/SigB基因ep PCR突變文庫的構建

雙酶切：取第二輪易錯PCR純化產物SigA、SigB基因和穿梭載體pBE3-MCS，分別采用XbaI/HindIII和KpnI/HindIII進行雙酶切，酶切體系和條件見表3。酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳確定酶切效果。

純化：取酶切效果良好產物，采用天根公司普通瓊脂糖凝膠回收試劑盒（DP209）對SigA、SigB基因和穿梭載體pBE3-MCS的雙酶切產物進行回收，對回收產物進行DNA濃度和純度檢測。

表3 易錯PCRSigA/SigB基因和pBE3-MCS雙酶切體系及條件Table 3 Double enzyme digestion system and conditions of error-prone PCRSigA/SigBgene and pBE3-MCS

連接：按照DNA Ligation Kit Ver.1（Code No.6021）說明書，各取8 μLSigA和SigB純化酶切產物，分別加入2 μL pBE3-MCS片段配制成混合溶液，加入10 μL溶液I，充分混勻，16℃反應30 min后，分別加入1 μL溶液III混勻。

轉化：各取10μL連接體系加入到200μLBL21（DE3）感受態細胞中進行轉化，各取100μL轉化細胞涂至含100μg/mL氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養18 h，獲得SigA和SigB基因易錯PCR突變文庫。

菌落PCR驗證：各取含100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基3 mL注入E.coliBL21（DE3）/pBE3-ep-SigA/SigB平板中，洗下單菌落加入到10 mL試管，補充含100 μg/mL的LB液體培養基至5 mL，于37℃、200 r/min條件下振蕩培養12 h后，進行菌液PCR鑒定。

雙酶切驗證：經菌液PCR驗證后，挑取陽性克隆子的重組質粒進行雙酶切驗證。

1.3.5L.fusiformis-pBE3-ep-SigA/SigB工程菌的構建

提取陽性克隆子菌液質粒，經電轉化導入L.fusiformis感受態細胞中。電轉化參數為電壓2 000 V，電容25 μF，電阻200 Ω，時間5.2 ms。取200 μL轉化液涂至含卡那霉素（50μg/mL）和2%乙醇的乙酸鈉培養基平板，34℃培養16h。

1.3.6 抗高乙醇和低pH己酸產生菌株L.fusiformis-pBE3-ep-SigA/SigB的篩選

己酸含量的檢測：參考薛正楷等的方法[15]。

乙醇耐受性的測定：取2mL含2%乙醇的改良麥氏培養基加入到1.3.5的平板上，洗滌克隆子，取200 μL洗滌液加入到含2%、4%、6%、8%、10%、12%乙醇和50 μg/mL卡那霉素的10mL乙酸鈉培養基中，90℃水浴5min，置于0.08MPa、34℃真空培養箱中靜置培養1 d后，按50 μg/mL加入卡那霉素繼續培養10 d，觀察氣泡出現時間并檢測10 d發酵液中己酸含量。

pH耐受性的測定：按5%接種量接種至pH值為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5和5.0的10 mL最大乙醇含量且能產氣泡的改良麥氏培養基中，培養至產氣泡，取pH值耐受性最高且產氣改良麥氏培養基涂板，隨機挑選10個單克隆子至10 mL含8%的乙醇和50 μg/mL的卡那霉素改良麥氏培養基中，培養10 d，檢測己酸含量。

1.3.7 抗高乙醇和低pH己酸產生菌株L.fusiformis-pBE3-ep-SigB的鑒定

菌落PCR鑒定：采用下列PCR體系和條件對1.3.5項下單克隆菌液，進行菌液PCR鑒定，反應體系：2×Tsingke mastermix25μL，模板1μL，上下游引物各1μL，菌液0.3μL，補雙蒸水到50 μL；反應條件同1.3.3。

測序結果分析：取PCR鑒定陽性菌液1 mL送上海生工生物工程有限公司進行基因測序，

將測序結果與美國國家生物技術信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）數據庫進行比對分析。

2 結果與分析

2.1 SigA/SigB基因易錯PCR條件的優化

按照均勻試驗設計，對L.fusiformis SigA/SigB基因進行隨機突變，結果見圖1。

圖1 SigA/SigB基因易錯PCR結果Fig.1 Results of error-prone PCR ofSigA/SigBgene

由圖1A可知，SigB基因第一輪PCR產物中，所有條件下的SigB基因均較清晰，本試驗選用試驗5號條件進行SigB基因第二輪PCR擴增，電泳檢測結果見圖1B。由圖1B可知，SigB第二輪易錯PCR擴增產物以試驗5號條件為最好，因此，本試驗采用試驗5號條件進行第二輪SigB基因的易錯PCR擴增。由圖1C可知，在SigA基因的第一輪PCR產物中，試驗5號產物濃度較高，且特異性較高，因此本試驗采用試驗5號條件進行第二輪PCR擴增，結果見圖1D。由圖1D可知，相對于其他易錯PCR體系而言，試驗4號為SigA基因較為適宜的第二輪PCR條件，因此，本試驗采用試驗4號進行SigA基因的第二輪PCR擴增。

2.2 SigA/SigB基因易錯PCR突變庫的構建與初步鑒定

以優化的易錯PCR條件和第一輪易錯PCR產物為模板，分別對SigA和SigB為模板進行第二輪PCR擴增，將第二輪擴增產物擴增產物進行膠回收純化，將純化產物和pBE3-MCS分別用XbaI/HindIII和KnpI/HindIII進行雙酶切，并對酶切產物采用Takara連接試劑盒進行連接，連接產物轉化感受態大腸桿菌BL21，按每板100 μL接種至含50 μg/mL卡那霉素平板中，34℃培養14 h，觀察轉化板菌落，獲得SigA/SigB易錯PCR突變庫。

取1mL含50 μg/mL卡那霉素LB培養基，加入易錯PCR突變庫平板中，洗出易錯PCR突變庫平板克隆子，接種至3支5mL含50μg/mL卡那霉素LB培養基中，于34℃、180r/min條件下培養14 h，取3 μL進行菌液PCR鑒定。提取PCR鑒定正確的菌液質粒，進行雙酶切鑒定，結果見圖2。

由圖2可知，提取的重組質粒PBE3-ep-SigA和PBE3-ep-SigB分別經XbaI-HindIII和KnPI-HindIII雙酶切后，在1100bp左右（圖2A）和900 bp多（圖2B）有條帶，分別與SigA和SigB基因大小相符合，說明工程菌E.coliBL21（DE3）/PBE3-ep-SigA/SigB構建成功。

圖2 重組質粒PBE3-ep-SigA和PBE3-ep-SigB雙酶切結果Fig.2 Results of double enzyme digestion of recombinant plasmid PBE3-ep-SigAand PBE3-ep-SigB

2.3 抗高乙醇和低pH己酸產生菌株L.fusiformis-pBE3-ep-SigA/SigB的篩選

檢 測 菌 株L.fusiformis、L.fusiformis-PBE3-SigA、L.fusiformis-PBE3-SigB、L.fusiformis-PBE3-ep-SigA和L.fusiformis-PBE3-ep-SigB發酵10 d后發酵液中的己酸含量，結果見表4。

表4 不同脅迫條件下的己酸產量比較Table 4 Comparison of caproic acid yield under different stress conditionsmg/100 mL

由表4可知，在抗乙醇脅迫條件下，出發菌L.fusiformis的抗乙醇最高濃度為4%，其己酸含量為264.35 mg/mL；L.fusiformis-PBE3-SigA和L.fusiformis-PBE3-SigB的抗乙醇濃度為6%左右，其己酸濃度分別為175.45 mg/mL和198.46 mg/mL；L.fusiformis-PBE3-ep-SigA和L.fusiformis-PBE3-ep-SigB的耐乙醇濃度為8%左右，其己酸濃度為137.45 mg/mL和277.68 mg/mL，因此，出發菌轉入SigA和SigB基因獲得的重組菌株及其易錯PCR重組突變菌株均能提高其在脅迫條件的產己酸能力，且L.fusiformis-ep-SigB在高乙醇濃度條件下的產己酸能力高于L.fusiformis-PBE3-ep-SigA達102%；在抗pH值脅迫條件下，出發菌L.fusiformis和重組菌L.fusiformis-PBE3-SigA、L.fusiformis-PBE3-SigB的抗pH均為3.5，其己酸產量分別為23.54mg/100mL、86.36mg/100mL和96.43mg/100mL，但重組菌己酸產量高于出發菌，易錯PCR重組菌L.fusiformis-PBE3-ep-SigA和L.fusiformis-PBE3-ep-SigB的抗pH值分別為3.0和2.5，其己酸產量分別為35.44 mg/100 mL和77.00 mg/100 mL，因此在pH脅迫條件下，易錯PCR重組菌L.fusiformis-PBE3-ep-SigB產己酸量高于易錯PCR重組菌L.fusiformis-PBE3-ep-SigA達263.7%，因此，本研究采用L.fusiformis-PBE3-ep-SigB菌株進行后續研究。

2.4 抗高乙醇和低pH己酸產生菌株L.fusiformis-ep-SigB的鑒定

從L.fusiformis-PBE3-ep-SigB突變庫中，隨機挑取6個單克隆進行菌落PCR鑒定，結果見圖3。由圖3可知，PCR產物電泳條帶與目的基因大小相符，說明L.fusiformis-PBE3-ep-SigB單克隆菌株構建成功。

圖3 L.fusiformis-PBE3-ep-SigB的PCR鑒定結果Fig.3 Results of PCR identification ofL.fusiformis-PBE3-ep-SigB

2.5 L.fusiformis-ep-SigB產己酸鑒定

經菌落PCR驗證正確的菌株L.fusiformis-PBE3-ep-SigB在8%乙醇濃度，pH3.5條件下發酵10 d，采用氣相色譜測定發酵液中的己酸含量，結果見表5。由表5可知，在高酸度和高乙醇濃度發酵條件下，L.fusiformisPBE3-ep-SigB產己酸能力顯著高于L.fusiformis-PBE3-SigB和L.fusiformis（P＜0.01），說明成功選育高抗性產己酸工程菌株。

表5 高抗性產己酸菌株的己酸產量測定結果Table 5 Determination results of caproic acid yield for caproic acid-producing strain with high resistant

2.6 L.fusiformis-ep-SigB產己酸菌株的測序鑒定

取取己酸產量最高的菌酸菌菌液500 μL，送上海生工進行測序結果，將測序結果采用NCBI工具blast（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行比較，結果見圖4。

圖4 L.fusiformis-ep-SigB菌株突變株測序結果Fig.4 Sequencing results of mutant strain ofL.fusiformis-ep-SigB strain

由圖4A可知，L.fusiformis-ep-SigB突變株的易錯基因（SigBv）與出發基因（SigB）相比，有7個點突變位點，分別是95位（C→G）、232位（A→T）、324位（T→A）、505位（C→G）、545位（C→G）、602位（G→C）、723位（A→T）；由圖4B可知，其蛋白質序列有44位（T→R）、81位（N→Y）、100位（H→Q）、176位（H→D）、198位（T→R）、208位（R→P）、251位（Q→H）共7個氨基酸發生突變。

3 結論

σ因子SigA和SigB基因經優化的易錯PCR條件進行兩輪易錯PCR突變，分別建立SigA和SigB的易錯PCR突變庫，通過epSigA/SigB基因與表達載體pBE3-MCS連接，構建L.fusiformis-PBE3-ep-SigA和L.fusiformis-PBE3-ep-SigB菌體庫，將兩種菌體庫在pH值2.0～5.0和乙醇含量2%～12%條件下進行篩選。結果表明，L.fusiformis-PBE3-ep-SigB重組菌株最高耐乙醇含量為8%左右，最低耐pH值為2.5左右；當乙醇含量為8%、pH值為3.5時，L.fusiformis-PBE3-ep-SigB重組菌株的己酸產量到達（254.35±39.74）mg/100 mL，為出發菌L.fusiformis己酸產量（93.62±10.33）mg/100 mL的271.68%，表明L.fusiformis-PBE3-ep-SigB重組菌株是具有較強的抗高乙醇濃度和低pH值脅迫能力的優良己酸產生菌株。

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