高效液相色譜法測定黑曲霉xj菌絲體中糠醛的含量

張 素，肖 洋，吉玉玉，邱 勇，黃 婕，李 祝*

（1.貴州大學 生命科學學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省煙草公司畢節(jié)市公司，貴州 畢節(jié) 551700；3.貴州省產品質量檢驗檢測院，貴州 貴陽 550003）

糠醛（furfural）又稱2-呋喃甲醛，是呋喃環(huán)系最重要的衍生物。在1832年被發(fā)現(xiàn)，最初是通過米糠（furfur）與稀酸共熱來獲得的，所以叫糠醛[1]。糠醛分子式為C5H4O2，是羰基化合物的一種，化學性質活潑。以糠醛為原料能直接或間接衍生如糠醇、糠酸、呋喃、四氫糠醇等物質，還可通過與甲醛的羥甲基化作用生成5-羥甲基糠醛。工業(yè)生產方法都是用木材或農林副產品等在催化劑的作用下通過水解，將戊聚糖轉化為戊糖，戊糖再經脫水環(huán)化生成糠醛的方法進行生產的[2]。目前糠醛制備主要集中在黑曲霉聯(lián)合水解花生殼、玉米芯之類[3-5]，但沒有黑曲霉獨立產糠醛的相關報道。對于糠醛的分析方法主要有肟化法、四溴化法、比色法[6]、電位滴定法[7]等，但這些方法測定操作復雜，易產生干擾且準確度不高。用高效液相色譜法測定油中糠醛含量已有報道[8-9]，但對于測定微生物菌絲體中糠醛含量的研究并不多。高效液相色譜法是近幾年興起的一門技術，具有檢測速度快、分析效率高、靈敏度高等特點，在食品檢測中得到了廣泛應用[10-11]。采用高效液相色譜法分析，確定該菌株發(fā)酵能夠產生糠醛，且具有簡便、快速、準確度高等優(yōu)點。因此使用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測定黑曲霉菌絲體中糠醛含量，可為今后探索黑曲霉菌絲體中存在物質提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑曲霉（Aspergillus niger）xj（保藏號：M206021）：中國典型培養(yǎng)物保藏中心；糠醛標準品（純度99.9%）：德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；乙醚、無水乙醇、冰乙酸（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；甲醇、乙腈（色譜純）：美國TEDIA公司；本實驗所用水為超純水；馬鈴薯葡萄糖瓊脂potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基為實驗用普通培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設備

Agilent 1100高效液相色譜儀（含在線脫氣機、四元梯度泵、自動進樣器、二極管陣列檢測器（diode-arraydetector，DAD）、Agilent色譜工作站）：美國Agilent公司；FA2204N電子分析天平：上海向帆儀器有限公司；TGL-16M臺式高速冷凍離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：SpheriorbC18（5μm，4.6mm×150mm）；流動相：乙睛∶0.1%乙酸水（冰乙酸調）=10∶90（V/V）；流速：1.0mL/min；檢測波長：277 nm；柱溫：30℃；進樣體積：10 μL。

1.3.2 菌絲體的制備

將黑曲霉xj菌株接于PDA固體斜面培養(yǎng)基上，27℃靜置培養(yǎng)3～5 d，活化2～3次，于4℃保存?zhèn)溆茫粚⒒罨玫木辏瞥删绘咦討乙海粚㈡咦討乙阂?%～12%（V/V）接種量接種于裝有PDA液體種子培養(yǎng)基的10 L發(fā)酵罐中，26～28℃、100～120r/min、通氣量控制在500～700L/h的條件下小罐培養(yǎng)2～3 d，得種子液；取種子液以10%～15%V/V）接種量接種于裝有PDA發(fā)酵培養(yǎng)基的80 L發(fā)酵罐中，26～28℃、攪拌速度80 r/min、通氣量控制在2.5 m3/h的條件下大罐培養(yǎng)3～5d終止發(fā)酵，4層無菌紗布過濾除去發(fā)酵液，收集菌絲體。

1.3.3 菌絲體的提取

將干燥菌絲體研磨成粉末，稱取10 g菌絲體于150 mL沸水抽提8 h，紗布過濾后8 000 r/min離心20 min。取上清液加入150 mL乙醚萃取（重復兩次，合并萃取液得200 mL），將所得萃取液常溫揮干，以甲醇溶解定容至5mL，過0.45μm濾膜[12]，上機待測。

1.3.4 糠醛標準曲線的繪制

標準儲備液的配制：準確稱取糠醛標準品1mg，用1mL甲醇溶解，所得質量濃度為1 mg/mL。將標準儲備液稀釋成質量濃度為1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL標準溶液，按照上述條件進行測定。以質量濃度（x，μg/mL）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標作圖繪制糠醛HPLC標準曲線。

2 結果與分析

2.1 檢測條件的確定

采用Spheriorb C18柱（5 μm，4.6 mm×150 mm），以乙睛∶0.1%乙酸水（冰乙酸調）=10∶90（V/V）為流動相，流速1.0 mL/min，波長為277 nm。實驗選擇乙腈作為有機流動相，分離效果清晰，雜質峰干擾小。在此色譜條件下，糠醛呈現(xiàn)較好的分離效果和重現(xiàn)性。

2.2 標準曲線及線性關系的考察

以質量濃度（x，μg/mL）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標作圖得糠醛HPLC標準曲線，結果見圖1。由圖1可知，糠醛線性回歸方程為y=60.851x+73.745（R2=0.999），線性范圍在糠醛質量濃度1～50 μg/mL之間呈良好的線性關系，滿足樣品測試要求。

圖1 糠醛HPLC標準曲線Fig.1 HPLC standard curve of furfaral

2.3 儀器精密度的考察

精密吸取20 μg/mL的糠醛對照品溶液10 μL，按上述測定條件連續(xù)進樣8次，精密度實驗結果見表1。由表1可知，糠醛測定結果的相對標準偏差（relative standaral deviation，RSD）為0.77%，精密度滿足方法學定量要求。

表1 精密度實驗結果Table 1 Results of precision experiments

2.4 重復性實驗

精密稱取同一批次菌絲體樣品各6份，照上述供試溶液的制備方法和測定條件，制備6份供試溶液并測定，重復性實驗結果見表2。由表2可知，對同一批次樣品多次取樣分析，RSD為0.98%，表明該方法具有良好的重現(xiàn)性。

表2 重復性實驗結果Table 2 Results of repeatability experiments

2.5 加標回收率實驗

向糠醛標準品溶液中添加黑曲霉菌絲體9份，分為低、中、高3種濃度水平（各濃度平行3次）。按照樣品處理方法處理樣品并測定，計算回收率，結果見表3。結果（表3）表明，樣品回收率均在90.51%～93.54%，RSD為1.9%，誤差在允許范圍之內。

表3 回收率實驗結果Table 3 Results of recovery rate experiments

2.6 樣品測定

糠醛標準品及黑曲霉菌絲體樣品中糠醛含量測定高效液相色譜圖見圖2，其中糠醛的保留時間為5.482 min，經計算黑曲霉菌絲體中糠醛的含量為1.872 mg/kg。

圖2 糠醛標準品（A）及黑曲霉菌絲體樣品糠醛含量（B）測定高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of furfural standard(A)and furfural in Agergillus nigermyceium sample(B)

3 結論

本實驗采用乙醚萃取，通過高效液相色譜法測定黑曲霉菌絲體中糠醛的含量為1.872 mg/kg。測定條件：采用Spheriorb C18柱（5 μm，4.6 mm×150 mm），流動相為乙睛∶0.1%乙酸水（冰乙酸調）（體積比10∶90），柱溫30℃；流速1.0 mL/min，波長λ=277nm，進樣體積為10 μL。保留時間為5.482 min，最低檢出濃度為0.01 mg/kg，回收率為90.51%～93.54%，精密度試驗結果RSD為0.98%。

國內使用液相色譜法檢測糠醛對象主要集中在乳制品、酒類、醬油等，尚無關于檢測黑曲霉菌絲體中糠醛的報道。本文建立了檢測黑曲霉菌絲體中糠醛含量的分析方法，該方法具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、雜質少等特點，為今后黑曲霉菌絲體中糠醛含量的測定提供有效的分析方法和有意義的參考數(shù)據(jù)。

[1]白 巖.糠醛的性質及其生產[J].安徽冶金科技職業(yè)學院學報，2009，19（4）：48-51.

[2]李志松.糠醛生產工藝研究綜述[J].廣東化工，2010，37（3）：40-41.

[3]余先純，李湘蘇，龔錚午.黑曲霉聯(lián)合固體酸水解花生殼制備糠醛的研究[J].食品工業(yè)科技，2012，33（1）：230-233.

[4]高禮芳，徐紅彬，張 懿，等.高溫稀酸催化玉米芯水解生產糠醛工藝優(yōu)化[J].過程工程學報，2010，10（2）：292-297.

[5]李憑力，李加波，解利昕，等.木糖制備糠醛的工藝[J].化學工業(yè)與工程，2007，24（6）：525-527.

[6]周碧青，張素平，張金彪.分光光度法和比色卡法快速測定蜂蜜中羥甲基糠醛[J].分析實驗室，2016，35（5）：586-589.

[7]劉俊峰，易平貴，金一粟.電位滴定法快速測定糠醛[J].湘潭礦業(yè)學院學報，1999，14（1）：50-53.

[8]鄭東升，張仲旗.用液相色譜法檢測變壓器油中的糠醛含量[J].福建電力與電工，1995，15（1）：33-35.

[9]康衛(wèi)理，陳志勇，朱志奇.高效液相色譜儀用于油中糠醛分析的方法研究[J].河北電力技術，2000，19（4）：21-23.

[10]梁娜娜，韓 深，何 非.幾種紅葡萄酒過程中花色苷組成與CIELab參數(shù)的相關分析[J].中國釀造，2014，33（1）：782-786.

[11]焦雪麗.HPLC技術在食品檢測中的應用[J].企業(yè)技術開發(fā)，2010，29（11）：72-73.

[12]劉 超，方尚玲，李 習，等.HPLC法測定產醬香芽孢桿菌發(fā)酵液中糠醛的含量[J].釀酒，2012，39（4）：46-49.

[13]楊國先.醬香型白酒中糠醛的作用及測定方法的研究[J].計量與測試技術，2009，36（9）：78-79.

[14]MAMMAN A S,LEE J M,KIM Y C,et al.Furfural:hemicellulose/xylosederived biochemical[J].Biofuels Bioprod Bioref,2008,2(5):438-454.