響應面法優化紫蘇豆醬的制曲工藝

胡文康，孫 莉，熊 坤，付 彬，沈婉瑩，付彩霞，高 冰，汪 超，徐 寧*

（1.湖北工業大學 工業發酵湖北省協同創新中心 湖北省食品發酵工程技術研究中心，湖北 武漢 430068；

2.湖北省恩施土家族苗族自治州食品藥品檢驗檢測中心，湖北 恩施 445000；3.湖北土老憨調味食品股份有限公司，湖北 宜昌 443000）

豆醬是以豆類為主要原料，利用米曲霉等多種微生物共同發酵而制成的一種風味食品[1]。豆醬是我國歷史悠久的傳統發酵品，其的出現可以追溯到周朝，是最早關于我國先民制作豆醬所使用原料及工藝的文字記錄。豆醬制作過程中的每一環節都至關重要，而制曲過程更是其中最為關鍵的環節，在制曲過程中，許多因素都會影響最終豆醬成曲的質量。制曲過程為微生物的生長提供一系列條件，使其能夠大量繁殖，從而可以產生淀粉酶和蛋白酶等。酶的種類及活力的強弱直接決定了原料中蛋白質、淀粉類物質等的水解效果，最終影響所產豆醬風味、口感和品質。

紫蘇（Perilla frutescens）別名紅蘇、赤蘇，系一年生唇形科草本植物[2]。紫蘇的營養豐富，其中含有蛋白質、多種維生素及礦物質，還含有多酚、α-亞麻酸、黃酮和紫蘇醇等活性物質[3]。這些物質使得紫蘇具有抗氧化[4]、延緩機體衰老、改善記憶力的能力，同時兼具抗菌[5]、抗過敏[6]、抑制腫瘤[7]、降血脂[8]等多種作用。紫蘇曾經被忽視的狀況隨著人民群眾生活水平的日益提高而逐漸消失，其作為一種藥食兼用植物[9-10]已經在食品、醫藥以及香料等行業大放異彩[11-13]，市面上出現越來越多紫蘇產品。利用紫蘇和大豆共同發酵生產的紫蘇豆醬，能夠充分發揮紫蘇的營養價值和獨特風味，豐富傳統發酵調味品的種類。

多酚是一種具有抗衰老、消除自由基和抗氧化作用的食品抗氧劑[14]。作為豆醬主要原料的大豆中有多種含酚結構的大分子物質，在發酵時通過米曲霉等作用將會產生對豆醬風味和功能具有貢獻的酚類物質。此外酚類也是紫蘇中主要的次生代謝產物，通過微生物發酵有利于酚類物質的溶出。

本研究根據豆醬制曲過程中影響成曲品質的主要因素進行試驗，在單因素試驗的基礎上，以成曲中總酚含量做為響應值進行響應面試驗，得到紫蘇豆醬最優制曲工藝，為紫蘇豆醬制備提供理論性參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫蘇粉：湖北土老憨生態農業集團；黃豆、面粉：市售；米曲霉（Aspergillus oryzae）AS 3.951（滬釀 3.042）、黑曲霉Aspergillusniger）AS3.350：湖北省食品發酵工程技術研究中心；福林酚、碳酸鈉和甲醇：國藥集團化學試劑有限公司；沒食子酸（純度為99%）：阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.2 儀器與設備

ZXSR-1270生化培養箱：上海智城分析儀器制造有限公司；UV-1601紫外可見分光光度計：北京瑞利分析儀器有限公司；YM50-FY50壓力蒸汽滅菌器：上海三申醫療器械有限公司；Biosafer-10D臺式凍干機：賽飛中國有限公司；CT15RE離心機：日立工機株式會社。

1.3 實驗方法

1.3.1 成曲工藝流程

1.3.2 制曲環節流程

曲料配方為黃豆∶面粉=6.5∶3.5（g∶g），在試驗組中添加紫蘇粉代替部分面粉，再接入霉菌（米曲霉和黑曲霉）制得種曲。黃豆經潤水環節浸泡后，將黃豆在121℃條件下高壓蒸煮20 min，待其冷卻，接入種曲拌勻。置于制曲室中在34℃條件下培養，在培養10～12 h后，對其進行松曲，再培養19～22 h后，進行第二次松曲。將培養溫度調節至28～30℃，保持該溫度培養直至制曲結束。

1.3.3 單因素試驗

將紫蘇粉添加量、米曲霉與黑曲霉的復配比（以下簡稱為菌種復配比）、接種量和制曲時間為評價因素，依據表1中的因素水平和試驗條件，采用1.3.1中的流程進行制曲。得到成曲后，檢測其中的總酚含量。考察以上4個因素各對成曲中總酚含量的影響。每個試驗平行進行3次，取其測量結果平均值。

因素 水平 固定條件

紫蘇粉添加量/%3、7、11、15接種量0.3%、菌種復配比3∶1、制曲時間40 h接種量/%0.2、0.3、0.4、0.5紫蘇添加量11%、菌種復配比3∶1、制曲時間40 h菌種復配比（g∶g）2∶1、3∶1、4∶1、5∶1紫蘇添加量11%、接種量0.3%、制曲時間40 h制曲時間/h 36、40、44、48紫蘇添加量11%、接種量0.3%、菌種復配比3∶1

1.3.4 制曲工藝最優參數的確定

在1.3.3中所述單因素試驗的基礎上，根據Box-Behnken原理[15]，設計4因素3水平響應面分析試驗，其因素與水平見表2。

表2 制曲工藝優化響應面試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface analysis for koji-making technology optimization

1.3.5 總酚的提取及含量測定

成曲中總酚的提取方法參考XU L等[16]的報道，稱取10g冷凍干燥的成曲樣品，溶于100mL體積分數70%的甲醇溶液中，室溫超聲處理15min，隨后在離心機中以10000r/min轉速離心10 min。殘余底液繼續用上述方法提取，共提取3次。合并3次離心所得的上清液用于檢測總酚含量。

總酚含量檢測方法參考XU B J等[17]的報道。取0.5 mL樣品于10 mL比色管中，加入5.0 mL 10%福林酚后，室溫條件下靜置。待其反應5 min后，再加入4 mL 7.5%Na2CO3溶液，并用去離子水補充至10 mL，搖至均勻，室溫條件下靜置。靜置1 h后在波長760 nm處測其吸光度值。以沒食子酸為標準品作標準曲線，結果以每克樣品中含有的沒食子酸當量（gallic acid equivalent，GAE）表示（mg GAE/g）。

1.3.6 數據分析

上述試驗所得數據使用Design Expert 8.0.5b及SPSS軟件進行處理。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 紫蘇粉添加量對成曲中總酚含量的影響

紫蘇中含有大量的酚類物質，而酚類物質具有較強的抗氧化活性，發酵可顯著提高原料中酚類物質的含量[18]。以不加紫蘇的組別作為空白對照，紫蘇粉添加量對成曲中總酚含量的影響見圖1。由圖1可知，總酚含量隨著紫蘇粉添加量的增加，出現了先升后降的趨勢，在紫蘇粉添加量為11%時，成曲中總酚的含量達到最高，為5.74 mg GAE/g，與對照組相比，提高了39.6%；繼續添加紫蘇粉至15%時，比對照組提高了22.8%。適量加入紫蘇粉的確可以提高成曲中總酚含量，但過量加入紫蘇粉，其含有的黃酮、多酚等物質反而會抑制微生物的生長，影響酶系的分泌，進而造成成曲中總酚含量降低。故在響應面優化試驗中將紫蘇粉添加量定為7%、11%和15%。

圖1 紫蘇粉添加量對成曲中總酚含量的影響Fig.1 Effects of different perilla powder addition on the content of total phenols in finished koji

2.1.2 接種量對成曲中總酚含量的影響

以不加紫蘇的組別作為空白對照，接種量對成曲中總酚含量的影響見圖2。由圖2可知，當接種量為0.3%時，成曲中總酚含量達到最大，為5.81mgGAE/g，當接種量＞0.3%時，成曲中總酚含量開始減少，這是由于接種量過大會使得曲料內菌種的數量增加，使其對原料中可利用營養物質的競爭加劇，導致其中部分菌體由于無法獲得充足的養分而生長遲緩，進而影響到了最終菌種孢子的成熟，蛋白酶、纖維素酶和果膠酶等酶系的分泌也隨之減少，因此成曲中酚類物質含量反而下降[19]。故在響應面優化試驗中將接種量定為0.3%、0.4%和0.5%。

圖2 接種量對成曲中總酚含量的影響Fig.2 Effects of inoculum on the content of total phenols in finished koji

2.1.3 菌種復配比對成曲中總酚含量的影響

米曲霉單菌種制曲存在曲酶系不足的缺陷，而通過多菌種混合制曲不僅可以彌補這一不足，同時還可以提高所制成曲中的總酚含量，這能增加其抗氧化活性物質，提高成曲的品質，以不加紫蘇的組別作為空白對照，不同米曲霉與黑曲霉的復配比對總酚含量的影響見圖3。由圖3可知，當米曲霉與黑曲霉的比例為3∶1（g∶g）時，成曲中總酚含量達到最大，為6.02mgGAE/g。而加大這一比例后，其總酚含量反而減少，這可能是因為黑曲霉接種比例的減少，導致成熟的黑曲霉孢子數不足，影響酶的分泌，從而使成曲中酚類物質含量下降。故在響應面優化試驗中將米曲霉與黑曲霉的復配比定為3∶1、4∶1和5∶1（g∶g）。

圖3 菌種復配比對成曲中總酚含量的影響Fig.3 Effects of different compound strains ratio on the content of total phenols in finished koji

2.1.4 制曲時間對成曲中總酚含量的影響

制曲時間過短，會導致菌絲不能充分生長，且影響成曲品質，總酚含量較低；而制曲時間過長，則會沾染產生雜菌，導致最后成曲質量及其中總酚含量下降。以不加紫蘇的組別作為空白對照，制曲時間對成曲中總酚含量的影響見圖4。由圖4可知，制曲時間同為36 h時，加入紫蘇后的成曲中酚含量為4.02 mg GAE/g，與不加紫蘇的組相比，減少了6.9%，這可能是由于紫蘇要比黃豆含有更多的纖維素，需要米曲霉耗費更多的時間去合成分泌纖維素酶，使纖維素轉化為還原糖等物質。而隨著制曲時間的延長，成曲中總酚含量隨之急劇上升，之后的回落是由于制曲時間太長，酚類物質有所氧化。在制曲時間為44 h時存在峰值，總酚含量為5.60mgGAE/g。故響應面優化試驗中將制曲時間定為40 h、44 h、48 h。

圖4 制曲時間對成曲中總酚含量的影響Fig.4 Effects of koji-making time on the content of total phenols in finished koji

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗方案及結果

應用Box-Behnken原理進行響應面試驗，選擇紫蘇粉添加量、接種量、菌種復配比和制曲時間4個因素為自變量，以成曲中總酚含量（Y）為響應值，進行試驗，試驗結果見表3。

表3 制曲工藝優化響應面分析試驗設計方案及結果Table 3 Results and analysis of response surface analysis for koji making technology optimization

使用Design Expert 8.0.5b軟件，通過其中Box-Behnken Design模型處理表3數據，二次響應面回歸擬合得到成曲中總酚含量與紫蘇粉添加量、接種量、菌種復配比和制曲時間四因素之間的回歸方程為：Y=5.63-0.17A-0.15B-0.16C-0.027D-0.18AB+0.025AC-5×10-3AD+0.14BC-7.5×10-3CD-0.68A2-0.14B2+0.034C2-0.037D2，對模型進行分差分析及回歸系數顯著性檢驗，結果見表4。

由表4回歸方差分析顯著性檢驗表明，該模型回歸顯著（P＜0.05），失擬項不顯著，說明該模型與實際實驗擬合較好，故通過響應面法對紫蘇曲料的制備工藝進行的優化是合理可行的。

表4 響應面試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis of response surface experiments results

根據表4中：F（A）=9.00，F（B）=7.23，F（C）=7.96，F（D）=0.24，說明各因素條件對成曲品質的影響程度存在差異，按照其影響程度大小排序為紫蘇粉添加量＞菌種復配比＞接種量＞制曲時間。根據顯著性結果可知，回歸方程一次項A和平方項A2對結果影響極顯著（P＜0.01），一次項B和一次項C對結果影響顯著，其他因素對結果影響均不顯著。

2.2.2 響應面結果優化與分析

通過Design Expert 8.0.5b軟件，根據實驗數據，作出響應面分析圖，擬合出一系列響應面形狀，從而分析紫蘇粉添加量、接種量、菌種復配比和制曲時間交互作用對總酚含量的影響，響應面結果見圖5。

根據響應面模型與回歸方程，可得出理論最優制曲工藝條件為紫蘇粉添加量6.92%，接種量0.32%，菌種復配比1.94∶1（g∶g），制曲時間43.04h，總酚含量的理論值為6.07mgGAE/g。在考慮因素實際可操作性后，將上述最優制曲工藝條件修改為：紫蘇粉添加量7%，接種量0.3%，菌種復配比2∶1（g∶g），制曲時間44 h。在該條件下進行平行試驗3次，測量成曲中總酚含量，取平均值，結果為6.25 mg GAE/g，相對誤差為0.5%，說明回歸方程與實際情況擬合較好。

圖5 紫蘇粉添加量、接種量、制曲時間和菌種復配比交互作用對紫蘇豆醬成曲中總酚含量影響的響應面和等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interactions between perilla powder addition,inoculum,koji-making time and compound strain ratio on the content of total phenols in finished koji

3 結論

應用響應面法，在單因素的試驗的基礎上，通過Box-Behnken Design模型確定了紫蘇豆醬的最優制曲工藝，其工藝條件為紫蘇粉添加量7%，接種量0.3%，米曲霉與黑曲霉配比2∶1，制曲時間44h。該條件下所制得成曲中的總酚含量為6.25 mg GAE/g，相對誤差為0.5%。利用紫蘇制備的豆醬，不僅具有明顯的紫蘇風味，還比普通豆醬具有更多的酚類物質，使豆醬的品質得到提升，同時賦予豆醬特殊風味。

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