3種蟲(chóng)生真菌菌絲的游離氨基酸分析

徐 軍，汪家春*，李兆蘭，王 玥，陳雅琳

（1.上海健康醫(yī)學(xué)院醫(yī)療器械學(xué)院，上海 200093；2.中國(guó)人民解放軍海軍醫(yī)學(xué)研究所，上海 200433；3.南京大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210093；4.新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830000）

游離氨基酸又稱(chēng)非蛋白質(zhì)氨基酸，呈游離狀態(tài)，其種數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)蛋白質(zhì)氨基酸。游離氨基酸是許多中藥材的重要有效成分，廣泛分布于植物、動(dòng)物、微生物體內(nèi)。游離氨基酸具有重要的生物功效和藥用價(jià)值，作為臨床醫(yī)療和藥用也超過(guò)蛋白質(zhì)氨基酸[1-2]。目前，真菌菌絲體的氨基酸分析主要著重于食用菌蛋白質(zhì)氨基酸的分析，缺少對(duì)菌絲體的游離氨基酸組成的系統(tǒng)研究。有學(xué)者對(duì)蟲(chóng)生真菌的蛋白氨基酸進(jìn)行了分析，但是少見(jiàn)對(duì)蟲(chóng)生真菌游離氨基酸的分析。因此蟲(chóng)生真菌中各種游離氨基酸的種類(lèi)和含量的分布狀況，將可作為評(píng)價(jià)該蟲(chóng)生真菌菌絲的保健和藥用功效的重要指標(biāo)，為蟲(chóng)生真菌資源利用和應(yīng)用價(jià)值的評(píng)價(jià)提供技術(shù)和理論參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌種

3種蟲(chóng)生真菌的菌種：從冬蟲(chóng)夏草的菌核和子座的菌絲組織經(jīng)組織分離和克隆而獲得的純菌種，將試管母種通過(guò)擴(kuò)培，人工發(fā)酵培養(yǎng)而獲得大量菌絲體。菌絲經(jīng)過(guò)冷凍干燥、粉碎制成發(fā)酵菌粉，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品（24種），鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）、氯甲酸芴甲酯（9-fluorenylmethyl chloroformate，F(xiàn)MOC）（均為分析純）：美國(guó)Sigma公司；甲醇、乙腈（均為色譜純）：中國(guó)藥品生物制品鑒定所；水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1200型高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）：美國(guó)安捷倫科技公司；HypersilGold C18柱（250mm×4.6 mm，5μm）：美國(guó)賽默飛世爾公司；D2900旋轉(zhuǎn)式振蕩器：江蘇省太倉(cāng)市強(qiáng)樂(lè)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；CP225D電子分析天平：德國(guó)賽多利斯公司；JL型超聲波清洗器：上海杰理科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

24種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密稱(chēng)取24種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品各5 mg，加0.1 mol/L HCl溶解并定容至50 mL，制成24種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液。1.3.2衍生化試劑的配制

OPA衍生試劑：精密稱(chēng)取10 mgOPA，溶于1 mL混合液0.16 mL甲醇，0.14 mL硼酸緩沖液，0.69 mL純水，0.01 mL 3-巰基丙酸）混勻，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，現(xiàn)用現(xiàn)配。

FMOC衍生試劑：精密稱(chēng)取10 mg FMOC，溶于1 mL乙腈，混勻，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，現(xiàn)用現(xiàn)配。

硼酸緩沖液：稱(chēng)取2.48 g硼酸，加入約1.2 g NaOH，加水溶解并定容至100 mL，用2 mol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至10，4℃冰箱保存。

1.3.3 樣品溶液的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取菌絲粉200mg，加入體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇，60℃超聲提取30min，離心過(guò)濾，濾液定容至10 mL作為樣品液，4℃保存時(shí)間不超過(guò)24h。上柱前樣品液加鄰苯二甲醛（OPA）和氯甲酸芴甲酯（FMOC）混合，自動(dòng)衍生化，然后上柱。

1.3.4 HPLC測(cè)定游離氨基酸的種類(lèi)及含量分析

色譜條件：色譜柱為Hypersil Gold C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)338 nm，流動(dòng)相A：20 mmol醋酸鈉，0.3%四氫呋喃，0.02%三乙胺；流動(dòng)相B：100 mmol/L醋酸鈉∶甲醇∶乙腈=200∶450∶350，pH 2.2。梯度：0→60 min，B相5%→56%；64→68 min，B相100%，流速1.0 mL/min。外標(biāo)法定量，計(jì)算各種游離氨基酸的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC測(cè)定24種氨基酸的圖譜

24種游離氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖見(jiàn)圖1；蝙蝠蛾擬青霉、中國(guó)彎頸霉及中國(guó)被毛孢游離氨基酸的高效液相色譜圖見(jiàn)圖2。

圖1 24種氨基酸對(duì)照品的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatography of 24 amino acids reference substances

圖2 蝙蝠蛾擬青霉（A、B）、中國(guó)彎頸霉（C、D）、中國(guó)被毛孢（E、F）游離氨基酸的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatography of free amino acids inPaecilomyces hepiali(A、B),Tolypocladium sinensis(C、D),Hirsutella sinensis(E、F)

2.2 三種蟲(chóng)生真菌菌絲的游離氨基酸的種類(lèi)和含量

3種蟲(chóng)生真菌菌絲的游離氨基酸的種類(lèi)和含量比較見(jiàn)表1、表2。

表1 3種蟲(chóng)生真菌菌絲游離氨基酸種類(lèi)和含量和對(duì)照品的保留時(shí)間Table 1 Types and contents of free amino acids in mycelia of 3 entomogeneous fungi and retention time of standard

表2 3種蟲(chóng)生真菌菌絲游離氨基酸含量比較Table 2 Comparison of free amino acids contents in mycelia of 3 entomogeneous fungi

由表1、表2可知，蝙蝠蛾擬青霉含20種游離氨基酸，缺少組氨酸、胱氨酸、谷氨酰胺及牛黃酸這4種游離氨基酸；中國(guó)彎頸霉含23種游離氨基酸，缺少組氨酸；中國(guó)被毛孢含22種游離氨基酸，缺少瓜氨酸、γ-氨基丁酸，三者所缺游離氨基酸的種類(lèi)不同。蝙蝠蛾擬青霉有7種游離氨基酸含量高于其他2種蟲(chóng)生真菌菌絲，分別是天冬氨酸、酪氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴(lài)氨酸；中國(guó)彎頸霉有15種游離氨基酸含量高于其他2種蟲(chóng)生真菌菌絲，分別是谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、精氨酸、丙氨酸、胱氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、瓜氨酸、牛黃酸、γ-氨基丁酸、色氨酸等，中國(guó)被毛孢中組氨酸含量最高。蝙蝠蛾擬青霉和中國(guó)彎頸霉的鳥(niǎo)氨酸含量相同（0.21 mg/g）且高于中國(guó)被毛孢。3種蟲(chóng)草菌絲各自含量最高的游離氨基酸同是丙氨酸、脯氨酸，各自含量最低的游離氨基酸同是瓜氨酸和鳥(niǎo)氨酸。且都含有8種必需氨基酸。3種蟲(chóng)草菌絲在24種游離氨基酸含量分布的幅度和幅差上有明顯差別，中國(guó)彎頸霉的游離氨基酸含量為0.21～5.62mg/g，幅差為5.41mg/g；蝙蝠蛾擬青霉的游離氨基酸含量為0.98～2.85 mg/g；幅差為2.67 mg/g；中國(guó)被毛孢的游離氨基酸含量為0.080～1.82 mg/g；幅差較小為1.74 mg/g。

2.3 三種蟲(chóng)生真菌菌絲的重要類(lèi)別的游離氨基酸含量比較

表3 3種蟲(chóng)生真菌菌絲重要游離氨基酸含量比較Table 3 Comparison of essential free amino acids content in mycelia of 3 entomogeneous fungi

由表3可知，中國(guó)彎頸霉游離氨基酸總量及非必需游離氨基酸總量均最高，分別為37.29mg/g和29.68mg/g；其次是蝙蝠蛾擬青霉，分別為19.24mg/g和11.27mg/g；中國(guó)被毛孢含量較低，分別為13.07 mg/g和9.36 mg/g。蝙蝠蛾擬青霉必需游離氨基酸含量為7.97mg/g，中國(guó)彎頸霉為7.61mg/g，二者含量相接近；中國(guó)被毛孢為3.71mg/g。蝙蝠蛾擬青霉支鏈氨基酸含量最高為3.66mg/g，其次是中國(guó)彎頸霉（2.57%），再次是中國(guó)被毛孢（1.63 mg/g）。蝙蝠蛾擬青霉必需氨基酸占氨基酸總量和占非必需氨基酸總量的百分含量最高，分別為41.42%和70.71%；其次是中國(guó)被毛孢，分別為28.38%和39.62%；再次是中國(guó)彎頸霉，分別為20.41%和25.57%。中國(guó)彎頸霉的精氨酸含量為1.25 mg/g，牛磺酸含量為1.82mg/g；蝙蝠蛾擬青霉的精氨酸含量為1.03 mg/g，牛黃酸缺失；中國(guó)被毛孢的精氨酸含量為0.22 mg/g，牛黃酸含量為0.86 mg/g，后二者均低于中國(guó)彎頸霉。蝙蝠蛾擬青霉和中國(guó)彎頸霉的賴(lài)氨酸的含量接近，分別為0.98 mg/g和0.92 mg/g；中國(guó)被毛孢含量為0.62 mg/g，較前二者低。2.4重要游離氨基酸的功能解析

支鏈氨基酸是側(cè)鏈具有分枝的氨基酸，即纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸三種，支鏈氨基酸是治療很多重大疾病的有效氨基酸，特別是肝病的治療效果尤為顯著[3-6]。蝙蝠蛾擬青霉的支鏈氨基酸含量最高為3.66 mg/g。

精氨酸是一種半必需氨基酸，也是一種條件必需氨基酸，對(duì)新生兒也是一種必需氨基酸，精氨酸具有促人體激素分泌的作用，口服或靜脈注射可促進(jìn)垂體生長(zhǎng)激素的分泌增加，應(yīng)用于治療身材矮小癥。精氨酸是促進(jìn)胰島素生成作用最強(qiáng)的一種制劑，口服或靜脈注射可促進(jìn)胰島素的釋放明顯增多，可用于糖尿病的治療[7]。中國(guó)彎頸霉和蝙蝠蛾擬青霉的精氨酸含量較豐富，分別為1.25 mg/g、1.03 mg/g。

牛磺酸是一種重要的游離氨基酸，它可清除自由基、降血脂、減少動(dòng)脈粥樣硬化、預(yù)防冠心病的發(fā)生，可防止心肌缺血、抗心律失常、預(yù)防心衰、防止心肌梗死。?；撬峥纱龠M(jìn)大腦發(fā)育、提高記憶力[7]。中國(guó)彎頸霉的?；撬岷勘容^高為1.82 mg/g。

組氨酸可促細(xì)胞再生作用，增進(jìn)胃液分泌，用于治療胃潰瘍和十二指腸潰瘍[8-10]。中國(guó)被毛孢含一定量的組氨酸為0.21 mg/g。

3 結(jié)論

關(guān)于蟲(chóng)生真菌的氨基酸分析報(bào)道較少，已發(fā)表的文獻(xiàn)資料僅限于對(duì)蟲(chóng)生真菌的16種常見(jiàn)的氨基酸的分析[11-13]，本實(shí)驗(yàn)對(duì)3種重要蟲(chóng)生真菌的24種游離氨基酸分析，其游離氨基酸種類(lèi)和含量有一定的差別，顯然對(duì)三者的藥效作用有顯著影響，所以3種蟲(chóng)生真菌各有自主性和特異性，但有彌補(bǔ)和互補(bǔ)作用。蟲(chóng)生真菌種類(lèi)多、數(shù)量大、分布廣，迄今我國(guó)共記載約400種蟲(chóng)生真菌，占全世界種類(lèi)的一半左右[14]，蟲(chóng)生真菌的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用具有光明前景。蟲(chóng)生真菌的氨基酸研究和分析對(duì)保健品和藥品的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供了一類(lèi)新的生物資源和天然來(lái)源，具有一定的新穎性[15-16]。

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