依達拉奉對大鼠顱腦創傷后神經元凋亡的影響

林思寧，李建民，劉俊杰，李群喜，薛承景，趙雅寧，付愛軍

創傷性顱腦損傷(traumatic brain injury，TBI)是一種常見病、多發病，其后遺癥一直是危害人類健康的主要因素之一，研究[1]表明TBI后出現神經細胞凋亡，TBI后遲發性神經元凋亡是產生繼發性腦損害的重要途徑。目前，對顱腦創傷后神經細胞凋亡的確切機制尚未完全闡明，如何阻制顱腦損傷后遲發性神經元凋亡是當前TBI的研究熱點之一。依達拉奉是一種新型神經保護劑，具有氧自由基清除能力和抗脂質過氧化作用[2]。該研究通過構建閉合性顱腦損傷模型，探討依達拉奉對大鼠顱腦創傷后海馬區神經元凋亡的影響和神經保護作用機制。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器依達拉奉(批號：20150355；規格：30 mg/20 ml)購自南京先聲藥業有限公司；兔抗人Fas多克隆抗體、兔抗人門冬氨酸特異半胱氨酸蛋白酶-8(cysteine aspartic acid specific protease-8，Caspase-8)多克隆抗體購自福州邁新生物技術有限公司；PV-6001/6002二步法組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒購自上海赫澎生物科技有公司。Image-ProPlus 6.0圖像分析軟件為日本奧林巴斯公司產品；自由落體打擊裝置及顯微外科解剖器械均由華北理工大學醫學實驗中心提供。

1.2實驗方法

1.2.1分組及構建大鼠顱腦創傷模型96只健康SPF級雄性Wistar大鼠，體質量(300±20)g，購自北京華阜康生物科技有限公司，飼養于華北理工大學醫學實驗動物中心。隨機分為4組：正常組、假手術組、模型組、藥物組，每組24只。參照Marmarou et al[3]構建大鼠閉合型腦創傷模型，用40 g砝碼從25 cm高處墜落致重型腦損傷，假手術組僅切開頭皮縫合，不予以打擊，不傷腦組織。分籠飼養，于術后2～8 h恢復飲食；正常組正常飼養，不做任何處理。

1.2.2給藥方法藥物組于模型制作成功后即刻經尾靜脈注射給藥，依達拉奉，每次3 mg/kg，2次/d，直至各時相點處死；正常組、假手術組、模型組在相同時間內給予等量生理鹽水尾靜脈注射。

1.2.3腦組織取材與標本制備術后72 h選取Wistar大鼠，4%水合氯醛10 ml/kg麻醉，快速開胸暴露心臟，灌注生理鹽水，隨后灌注4%多聚甲醛至軀干僵硬時，斷頭取腦，4%多聚甲醛固定液中固定48 h以上。取出腦組織標本，以損傷灶為中心，切取厚約4 mm左右的組織標本，常規酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，視交叉處始冠狀面連續切片，厚度為4.5 μm，60 ℃烤箱烘烤4 h后，室溫下保存備用，用于免疫組化和TUNEL染色。每組另取腦組織0.5 g，放入4 ℃生理鹽水，在冰水浴中用玻璃勻漿器制成100 g/L的腦勻漿，低溫離心機3 000 r/min離心15 min，取上清液，-20 ℃凍存，用于檢測MDA、SOD水平。

1.2.4血清MDA、SOD測定采用硫代巴比妥酸比色法(TBA)檢測MDA水平，采用羥胺法檢測SOD水平，按照說明書操作[4]。取出上清液，滴加2 μl的樣品上清液于96孔板，每孔加100 μl的BCA混合液，用酶標儀(562 nm)測OD值，嚴格按照試劑盒說明書要求操作，分別檢測MDA和SOD水平。

1.2.5免疫組織化學法檢測Fas、Caspase-8表達常規海馬組織切片脫蠟至水，3% H2O2室溫孵育，滅活內源性過氧物酶，枸櫞酸鹽溶液100 ℃沸騰熱修復抗原；血清封閉液室溫孵育；分別滴加一抗Fas和Caspase-8(1 ∶200)，于4 ℃孵育過夜；滴加生物素標記的二抗工作液，37 ℃孵育，DAB顯色，蘇木精復染，流水沖洗反藍，0.1%鹽酸酒精分化，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學顯微鏡觀察并采集照片，采用Image-Pro-Plus圖像分析軟件分析圖片染色結果，依據染色分數(染色強度)評分評定結果。

1.2.6TUNEL檢測細胞凋亡常規海馬組織切片脫蠟脫水，3% H2O2室溫孵育10 min，以滅活內源性過氧化物酶，蒸餾水洗滌3次，每次2 min，胃蛋白激酶K(20 μg/ml)室溫孵育消化15 min，標記液(20 μl)37 ℃標記2 h，封閉液(50 μl)室溫孵育30 min，生物素化抗地高辛抗體(50 μl)，37 ℃孵育30 min，SABC(50 μl)37 ℃孵育30 min，TBS洗滌3次，每次5 min，DAB顯色，蘇木精復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，甘油封片，并于光學顯微鏡下觀察拍照，計數陽性凋亡細胞數(%)=凋亡細胞數/總細胞數×100%，取平均值。

2　結果

2.1各組血清MDA、SOD水平比較各組血清MDA、SOD含量比較差異均有統計學意義(F=48.836，P=0.001)、(F=176.460，P<0.001)，模型組MDA量均高于正常組、假手術組(P<0.05)；藥物組與模型組比較MDA量顯著減少(P<0.05)，但仍高于假手術組和正常組(P<0.05)；模型組SOD量均低于正常組、假手術組(P<0.05)；藥物組與模型組比較SOD量顯著增加(P<0.05)，但仍低于假手術組和正常組(P<0.05)；假手術組與正常組間兩者的含量比較差異無統計學意義。見表1。

表1　各組血清MDA、SOD含量比較

與模型組比較：△P<0.05；與藥物組比較：*P<0.05

2.2各組Fas、Caspase-8表達比較Fas、Caspase-8陽性表達定位于腦組織神經元細胞胞質或胞膜，陽性反應呈棕黃色染色。見圖1、2。經Image-Pro Plus圖像分析系統半定量分析得出積分光密度(IOD)值(表2)。各組Fas和Caspase-8表達比較差異均有統計學意義(F=120.934、94.597，P<0.001)，模型組Fas和Caspase-8表達量均高于正常組、假手術組(P<0.05)；藥物組與模型組比較Fas和Caspase-8表達量均減少(P<0.05)，但仍高于假手術組和正常組(P<0.05)；假手術組與正常組間兩者的表達量比較差異無統計學意義(P>0.05)。

圖1　免疫組織化學法檢測腦組織Fas表達　×400

圖2　免疫組織化學法檢測腦組織Caspase-8表達　×400

圖3　TUNEL染色檢測腦組織細胞凋亡　×400

組別FasCaspase-8正常27.84 ±1.29△10.78 ±2.29△假手術30.16±1.8213.83±3.12模型47.73±2.85*28.55±3.05*藥物38.21±2.0716.02±2.53F值120.93494.597P值<0.001<0.001

與模型組比較：△P<0.05；與藥物組比較：*P<0.05

2.3細胞凋亡情況TUNEL染色陽性凋亡細胞形態特征為神經元胞體縮小，染色質凝集，密度高，呈塊狀或顆粒狀，細胞核內出現棕色顆粒，見圖3。正常組、假手術組、模型組、藥物組的凋亡細胞指數(%)分別為(5.63±0.35)、(6.72±0.48)、(23.82±1.20)、(12.64±0.64)。各組之間凋亡細胞數差異有統計學意義(F=59.47，P<0.001)，模型組較正常組、假手術組凋亡細胞數顯著增多(P<0.05)；藥物組較模型組凋亡細胞數顯著減少(P<0.05)，但仍高于正常組和假手術組(P<0.05)；正常組和假手術組之間差異無統計學意義(P>0.05)。

3　討論

TBI導致繼發性血腦屏障破壞，引發顱腦水腫，局部缺血低氧導致大量自由基產生造成繼發性腦損傷。TBI產生的氧自由基可導致脂質過氧化反應，損傷生物膜引發線粒體腫脹破裂，細胞膜通透性增強并誘發神經細胞凋亡[5-6]。因此，如能阻止神經細胞凋亡，就有可能減輕TBI時腦損傷程度。

依達拉奉是一種新型的自由基清除劑，可將一個電子提供給自由基而達到清除自由基的目的[7]。因其分子結構含親脂基團，易通過血腦屏障到達腦組織，主要有清除氧自由基抑制脂質過氧化反應，降低血腦屏障通透性，降低腦水腫程度，調控炎癥因子，減少炎癥反應，抑制細胞凋亡等，發揮神經保護作用[8-9]。MDA是脂質過氧化的重要終產物之一，可間接反映機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度，SOD是機體抗氧化損傷防御體系中最重要的抗氧化酶之一，可間接反映機體清除氧自由基的能力；體內MDA含量及SOD活性的變化可反映機體清除自由基和抗氧化損傷的能力[10]。本研究結果表明模型組MDA量顯著增加，藥物組較模型組MDA量顯著減少；模型組SOD量顯著降低，藥物組較模型組SOD量顯著增加。說明依達拉奉可有效提高顱腦創傷后腦組織中SOD活力，降低MDA水平。

Fas屬于腫瘤壞死因子受體超家族，Fas與FasL結合或與激動抗體交聯后形成三聚體，再將Caspase-8募集于Fas信號復合體，通過介導Caspase激活的外源性激活途徑，再經過Caspase級聯反應最終導致細胞凋亡[11]。本研究結果顯示，顱腦創傷后大鼠腦組織Fas和Caspase-8表達明顯增高，凋亡細胞數明顯增加；而依達拉奉可使大鼠顱腦創傷后Fas和Caspase-8表達降低，凋亡細胞數減少。考慮顱腦損傷后其可能的作用機制為Fas與其配體FasL結合，通過胞質內Fas相關死亡域蛋白(FADD)，進一步和Caspase-8酶原發生相互作用，激活Caspase-8酶原，再經過Caspase級聯反應最終導致神經細胞凋亡，而自由基清除劑—依達拉奉可通過抑制上述Fas介導的死亡受體途徑信號通路，抑制Fas表達，進一步抑制其下游Caspase-8表達，抑制神經細胞凋亡，發揮顱腦保護作用[12]。