系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者B細胞中microRNA-155的表達及干預后效應

陳阿瓊 黃茜茜 葉璐璐 薛向陽 林巧愛 朱小春 李聲東

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種累及多系統(tǒng)的慢性自身免疫性疾病，針對細胞核抗原產(chǎn)生自身反應性抗體是其主要標志[1]。SLE患者的B細胞受損且不能區(qū)分自身抗原和非自身抗原，導致產(chǎn)生針對自身抗原的抗體并觸發(fā)過度炎癥反應[2]。microRNAs（miRNAs）是一類小的（21~25個核苷酸）、非編碼RNA，其通過與靶向mRNA序列的堿基配對調節(jié)轉錄后基因的表達[3]。有時miRNA可僅以2倍差異表達來調控靶基因從而減少蛋白質表達[4]。因此，相當難以識別在發(fā)生某些疾病時產(chǎn)生特定miRNA的生理功能。近年來已經(jīng)提出miRNAs作為SLE中免疫過程的重要調節(jié)劑[5-6]。miR-155為典型的多效miRNA，能廣泛調控免疫功能，包括T和B細胞活化，炎癥反應和免疫記憶[7]，其通過靶向少數(shù)基因如 SHIP1[8]、SCOS1[9]和 S1PR1[10]等增強免疫應答，促進免疫系統(tǒng)的過度活化。在類風濕關節(jié)炎、SLE等自身免疫性疾病中均可見其發(fā)揮致病作用[11]。在狼瘡小鼠模型中，miR-155的缺失減少了自身抗體的產(chǎn)生，可通過調節(jié)B細胞增殖來減輕狼瘡樣疾病[12]。為進一步探究miR-155在SLE患者B細胞中的作用，筆者檢測SLE患者和健康人B細胞中miR-155的表達水平，并利用miRNA抑制劑干預后進一步檢測IgG水平，現(xiàn)將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2011年2至12月和2014年6至12月溫州醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院門診及住院的SLE患者共66例，均符合1997年美國風濕病學會修定的SLE診斷標準，男 9 例，女 57 例，年齡 28～52（39.75±10）歲。選取同院體檢中心同期健康體檢者10例作為健康對照組，男 2 例，女 8 例，年齡 26～50（38±12）歲，年齡與性別與SLE患者匹配。

1.2 主要試劑與儀器 Tri-Reagent BD試劑購自美國Invirtogen，miRNA檢測試劑盒購于德國Qiagen公司，CD19 MicroBeads（human）購于德國 Miltenyi公司，人IgG ELISA檢測試劑盒購于瑞典Mabtech公司，人淋巴細胞分離液購于天津灝洋生物公司，DEPC水購自寶生物工程（大連）有限公司，ABI 7500型定量PCR儀為美國應用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品，其他試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 標本收集 采集新鮮外周靜脈血5ml，EDTA抗凝，3 000r/min離心10min，用移液槍吸出上層血漿至1.5ml EP管中，細胞沉淀用于外周血單個核細胞（PBMC）的分離。

1.3.2 PBMC的分離 細胞沉淀采用0.9%氯化鈉注射液1：2重懸；取6ml細胞懸液小心緩慢地用吸管加于6ml淋巴細胞分離液的液面之上，400g，離心20min；離心管中分層后，收集第二層的乳白色淋巴細胞放入含0.9%氯化鈉溶液4～5ml的試管中，充分混勻。再次離心，400g，離心20min。沉淀經(jīng)0.9%氯化鈉溶液反復洗2次即可得到所需的PBMCs。

1.3.3 外周血B細胞的分離 磁珠分離B細胞采用陰性選擇的原理，即被標記的非B淋巴細胞保留在分離柱的磁場內，而未被標記的B淋巴細胞通過了分離柱。流式細胞儀分析磁珠分選的B細胞的得率及純度。分離的PBMCs細胞計數(shù)后，300g，離心10min，徹底吸出上清液；預冷B細胞分離緩沖液，按每107個細胞需40μl的比例加入重懸細胞；根據(jù)每107個細胞需10μl的比例加入B細胞抗體雞尾酒試劑，混勻；放入冰箱（2～8℃）孵育5min；每107個細胞加入30μl B細胞分離緩沖液；每107個細胞加入20μlB細胞分離磁珠試劑，混勻；放入冰箱（2～8℃）孵育10min；將分離柱置于分離器適當?shù)拇艌鰞?，緩慢將孵育的細胞懸液加到分離柱中，同時收集流出的未被標記的細胞液；加入500μl緩沖液洗柱，共3次；將分離柱移出分離柱的磁場內，立即加入適當?shù)木彌_液，將標記的細胞推出至收集管中，即可得到分離出的B細胞。

1.3.4 流式細胞儀分析B細胞純度 重懸細胞并計數(shù)。再將細胞懸液分為4管（106個細胞數(shù)/管），設置實驗組和對照組，加入直接標記的一抗抗體，即抗人CD19-PE（1mg/1ml）5μl，終容量 100μl，具體為：實驗組：B細胞+抗人CD19-PE；對照組1：B細胞；對照組2：PBMCs+抗人CD19-PE；對照組3：PBMCs。輕輕混勻后，避光，室溫孵育30min；孵育完成后，加入緩沖液PBS，300g離心5min，棄去上清液，重復1次；重懸細胞后，上機檢測。

1.3.5 B細胞RNA的抽提 B淋巴細胞（105個細胞數(shù)/份）加入TRIzol試劑1ml，充分混勻后室溫靜置5min；加氯仿 200μl，混勻后冰上靜置 5min，4℃，12 000r/min離心15min，可見分層；取上層水相移至新的無酶EP管中，加入等體積異丙醇，充分混勻后，置于-20℃冰箱中過夜；4℃，12 000r/min離心15min，吸出上清液，留白色沉淀；加入1ml75%乙醇，4℃，8 000r/min離心15min后棄上清液；再次離心1min后，吸盡乙醇留白色沉淀；打開EP管蓋，冰上晾干至乙醇完全揮發(fā)，再加入DEPC處理水20μl溶解RNA，測濃度后-80℃保存。

1.3.6 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測miR-155的表達 取提取的RNA以miR-155莖環(huán)逆轉錄引物進行逆轉錄，20μl逆轉錄反應體系含：miScript Reverse Transcriptase Mix 2μl，10×miScript Nucleics Mix 2μl，5×miScript HiSpec Buffer 4μl，RNase-Free Water variable，Total RNA template 10pg-1μg，混勻，微離心置于冰上；37℃逆轉錄60min，95℃酶失活5min；-20℃保存逆轉錄產(chǎn)物cDNA或立即用于real-time PCR。real-time PCR：所用試劑置于冰上，取出制備好的cDNA，每個樣本作2個復孔；避光操作，調制20μl反應體系：2×QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix 10μl，10× miScript Universal Primer 2μl，10×miScript Primer Assay 2μl,RNase-Free Water variable，Template cDNA ≤2μl。反應起始條件 95℃預變性5min，循環(huán)反應條件（40個循環(huán)）94℃變性 15s，55℃退火30s，70℃延伸 30s，用 real-time PCR儀附帶的軟件導出原始數(shù)據(jù)，獲得每個孔中熒光信號到達設定閾值時的循環(huán)數(shù)，即Ct值。

1.3.7 細胞miRNA干預實驗 為評價miR-155對B細胞功能的影響，我們通過miRNA抑制劑下調miR-155的表達，采用ELISA檢測細胞上清液IgG水平變化。由于常規(guī)的轉染方案難以將基因導入B細胞，本研究采用電轉染方式對B細胞內的miRNA進行干預。分離外周血單個核細胞，細胞計數(shù)，6孔板培養(yǎng)，106個/孔細胞數(shù)；清洗電轉杯，75%乙醇浸泡1h后，無水乙醇浸泡0.5h后，紫外照射至乙醇完全揮發(fā)，放于-20℃過夜；6孔板內分別加入106個細胞及10μl mimics/mimics-NC/miRNA inhibitor/miRNA inhibitor-NC/Control（電轉但不加 miRNA）/Blank（不電轉也不加 miRNA），混勻，將溶液轉移到電轉杯中，按250V、10ms設置電轉儀參數(shù)；將電轉杯置于恒溫培養(yǎng)箱10min，使miRNA充分進入；將細胞懸液接種于預熱的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；培養(yǎng)48h后，收集細胞上清液和細胞，待檢測。

1.3.8 IgG抗體檢測 收集的細胞上清液，12 000r/min，4℃，10min離心備用；從已平衡至室溫的密封袋中取出試驗所需板條；空白孔加標準品和標本通用稀釋液，其余孔中加標本或不同濃度標準品（100μl/孔），用封板膠紙封住反應孔，36℃孵箱孵育90min；提前20min準備酶標抗體工作液；洗板5次；空白孔加酶標抗體稀釋液，其余孔加入酶標抗體工作液（100μl/孔），用新封板膠紙封住反應孔，36℃孵箱孵育30min；洗板5次；打開酶標儀電源，預熱儀器，設置好檢測程序；加入顯色底物（TMB）100μl/孔，避光 36℃孵箱，避光孵育 15min；加入終止液100μl/孔，混勻后即刻測量OD450值（3min內）。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，剔除CT值＞35或溶解曲線不合格的數(shù)據(jù)，計量資料以表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 外周血B細胞分離及純度鑒定 見圖1。

圖1 B細胞純度流式鑒定

由圖1可見，A01所示為沒有加CD19-PE抗體的B細胞對照管，目的是收集細胞以便劃分實驗管的細胞區(qū)域。A02是加有CD19-PE抗體的B細胞實驗管，在對照第一管劃分的基礎上，PE通道的細胞有約92%，即分離的B細胞純度能達到約92%。

2.2 SLE患者和健康對照組B細胞miR-155表達水平比較 見圖2。

圖2 SLE患者和健康對照組B細胞miR-155表達水平比較

由圖2可見，與健康對照組比較，miR-155在SLE患者B細胞中表達水平明顯上調（t=3.192，P＜0.05）。

2.3 miRNA干預對B細胞分泌IgG的影響 見圖3。

圖3 B細胞miRNA電轉染干預效率流式細胞儀評價

由圖3可見，熒光標記的miR-155轉染效率后流式細胞儀檢測攜帶熒光的細胞數(shù)量，B細胞轉染效率約40%。

2.4 SLE患者外周血B細胞miR-155干預48h后IgG水平 見圖4。

圖4 SLE患者外周血B細胞miR-155干預48h后IgG水平

由圖4可見，SLE患者B細胞上調表達的miR-155，通過miRNA抑制劑干預48h后，分泌的IgG水平明顯降低（P＜0.05）。

3 討論

B細胞通過多重途徑在SLE發(fā)病機制中起到關鍵作用，其中最主要途徑是B細胞產(chǎn)生病理性自身抗體，并通過形成免疫復合物、激活補體和直接細胞毒性引起組織損傷，基于耗竭B細胞的藥物，如利妥昔單抗等，在常規(guī)臨床實踐中用于治療頑固性SLE[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-155在活化的B細胞中表達且可能發(fā)揮著重要作用[14]，Vigorito等[15]發(fā)現(xiàn)miR-155缺乏的B細胞出現(xiàn)濾泡外和生發(fā)中心反應減少。本研究采用qRT-PCR，發(fā)現(xiàn)miR-155在SLE患者B細胞中表達上調。此外，采用miRNA抑制劑降低B細胞中miR-155的表達后，檢測到細胞上清液IgG水平明顯減少，提示miR-155可調控B細胞產(chǎn)生IgG，進一步證實miR-155是SLE患者B細胞功能相關的miRNA。miR-155在B細胞中如何發(fā)揮作用需要進一步研究。Vigorito等[15]通過miR-155-缺陷B細胞中基因表達的全基因組分析，發(fā)現(xiàn)總共185個蛋白編碼基因受到顯著影響，特別是PU.1（Ets家族轉錄調節(jié)子）被鑒定為B細胞中miR-155的功能靶區(qū)，野生型原代B細胞中的強制表達PU.1可導致表達IgG1細胞比例降低。多項研究數(shù)據(jù)表明miR-155-SHIP1軸也可能在調節(jié)B細胞活化和存活中起重要作用[8,16]。近期又有研究證實miR-155直接抑制Jumonji家族成員JARID2，從而減少B細胞凋亡[17]。

B細胞的過度活化被認為是SLE重要發(fā)病機制，miR-155在B細胞中的調控或許與SLE疾病發(fā)生、發(fā)展有關。2015年Liu等[18]報道在EBV等特定病毒或細菌感染后，SLE患者B細胞中的miR-155可以在TLR9誘導下靶向作用于CD1d的3′-UTR區(qū)域，從而損害B細胞的抗原呈遞功能。同年Lou等[19]報道，miR-155與B細胞抗體反應有關。這些報道均證實了miR-155與SLE患者B細胞的功能息息相關。本實驗也提示miR-155的過度表達可能通過促進SLE患者B細胞產(chǎn)生IgG，促進自身抗原抗體復合物的形成，從而誘導免疫炎癥反應對機體產(chǎn)生損傷。當然，miR-155如何在SLE中調控B細胞發(fā)揮致病作用仍需進一步深入研究。

綜上所述，miR-155從多方面影響B(tài)細胞的功能，本研究也證實miR-155在SLE患者B細胞中表達上調，且抑制miR-155可降低B細胞產(chǎn)生IgG，這也為改善SLE治療提供可行的新策略。

4 參考文獻

[1]Price JV,Haddon DJ,Kemmer D,et al.Protein microarray analysis reveals BAFF-binding autoantibodies in systemic lupus erythematosus[J].The Journal of clinical investigation,2013,123(12)：5135-5145.

[2]Nashi E,Wang Y,Diamond B.The role of B cells in lupus pathogenesis[J].The internationaljournalof biochemistry&cellbiology,2010,42(4)：543-550.

[3]Zhang B,Farwell MA.microRNAs：a new emerging class of players for disease diagnostics and gene therapy[J].Journal of cellular and molecular medicine,2008,12(1)：3-21.

[4]Ebert MS,Sharp PA.Roles for microRNAs in conferring robustness to biologicalprocesses[J].Cell,2012,149(3)：515-524.

[5]Amarilyo G,La Cava A.miRNA in systemic lupus erythematosus[J].Clinicalimmunology(Orlando,Fla.),2012,144(1)：26-31.

[6]Shen N,Liang D,Tang Y,et al.MicroRNAs-novel regulators of systemic lupus erythematosus pathogenesis[J].Nature reviews,Rheumatology,2012,8(12)：701-709.

[7]Vigorito E,Kohlhaas S,Lu D,et al.miR-155：an ancient regulator of the immune system[J].Immunological reviews,2013,253(1)：146-157.

[8]O'Connell RM,Chaudhuri AA,Rao DS,et al.Inositol phosphatase SHIP1 is a primary target of miR-155[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2009,106(17)：7113-7118.

[9]Rasmussen TK,Andersen T,Bak RO,et al.Overexpression of microRNA-155 increases IL-21 mediated STAT3 signaling and IL-21 production in systemic lupus erythematosus[J].Arthritis research&therapy,2015,17：154.

[10]Xin Q,Li J,Dang J,et al.miR-155 Deficiency Ameliorates Autoimmune Inflammation of Systemic Lupus Erythematosus by Targeting S1pr1 in Faslpr/lpr Mice[J].Journal of immunology,2015,194(11)：5437-5445.

[11]Leng RX,Pan HF,Qin WZ,et al.Role of microRNA-155 in autoimmunity[J].Cytokine&growth factor reviews,2011,22(3)：141-147.

[12]Thai TH,Patterson HC,Pham DH,et al.Deletion of microRNA-155 reduces autoantibody responses and alleviates lupus-like disease in the Fas(lpr)mouse[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2013,110(50)：20194-20199.

[13]孫惠力，尹培達.利妥昔單抗治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡研究進展[J].中華風濕病學雜志,2006,10(6)：369-371.

[14]Costinean S,Zanesi N,Pekarsky Y,et al.Pre-B cell proliferation and lymphoblastic leukemia/high-grade lymphoma in E(mu)-miR155 transgenic mice[J].Proceedings of the National A-cademy of Sciences of the United States of America,2006,103(18)：7024-7029.

[15]Vigorito E,Perks KL,Abreu-Goodger C,et al.microRNA-155 regulates the generation of immunoglobulin class-switched plasma cells[J].Immunity,2007,27(6)：847-859.

[16]Pedersen IM,Otero D,Kao E,et al.Onco-miR-155 targets SHIP1 to promote TNFalpha-dependent growth of B cell lymphomas[J].EMBO molecular medicine,2009,1(5)：288-295.

[17]Crepeau RL,Zhang P,Usherwood EJ.MicroRNA miR-155 Is Necessary for Efficient Gammaherpesvirus Reactivation from Latency,but Not for Establishment of Latency[J].Journal of virology,2016,90(17)：7811-7821.

[18]Liu F,Fan H,Ren D,et al.TLR9-induced miR-155 and Ets-1 decrease expression of CD1d on B cells in SLE[J].European journalofimmunology,2015,45(7)：1934-1945.

[19]Lou Z,Casali P,Xu Z.Regulation of B Cell Differentiation by Intracellular Membrane-Associated Proteinsand microRNAs：Role in the Antibody Response[J].Frontiers in immunology,2015,6：537.