山楂葉總黃酮對NAFLD肝細胞凋亡影響的研究

黎運呈 曾芳 王秋景 鄭迪 楊喆娟

隨著人們生活水平的提高，非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）患者日益增多。NAFLD進一步發展，約15%患者發展至肝硬化，3%進展至最終的肝衰竭[1-3]。NAFLD是一類肝組織學改變與酒精性肝病相類似，但無過量飲酒史的臨床病理綜合征[4]。NAFLD在臨床上以肝功能異常為主要表現，肝細胞的病理損傷尤以肝細胞線粒體損傷較為顯著。線粒體是肝細胞重要的細胞器之一，同時也是具有完整結構和生化功能復雜、多變的細胞器，細胞內和細胞外環境的變化可導致線粒體的結構和功能異常，而肝線粒體的病變與細胞凋亡的發生密切相關[5-6]。現代藥理學研究表明，山楂葉總黃酮（hawthorn leaves flavonoids，HLF）具有降血脂、抗氧化、降糖、抗血小板聚集等作用[7-8]。筆者通過觀察HLF對NAFLD細胞凋亡的影響，旨在揭示NAFLD發病的分子機制，為中藥干預治療NAFLD提供理論依據，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 HLF（長春三九生物制藥，批號：20140823）；人正常肝細胞L-02株，購自中科院上海細胞研究所細胞庫；FBS購自杭州四季青公司；油酸（OA）購自天津風船化學試劑科技有限公司；軟脂酸（PA）、油紅O、二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司;達氏修正依氏培養基（DMEM）和小牛血清（FCS）購于美國Gibco公司；TG試劑盒、考馬斯亮藍蛋白定量試劑盒購自南京建成生物工程公司。化學藥品與試劑：Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購于美國BD公司；MTT購于瑞士羅氏公司；SDS-PAGE試劑購于美國Sigma公司；PVDF膜購于德國 Millipore公司；Caspase-9、Bcl-2、Bax和 β-actin抗體購于Cell Signaling Technology；羊抗兔和羊抗鼠二抗購于美國Bethyl公司。Cytochrome C購于美國Bio－Vision公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人正常肝L-02細胞用含有10%FBS的DMEM培養液，于37℃、含5%CO2的溫箱中培養72h，細胞70%～80% 融合時，以0.25%胰酶/0.02%EDTA消化傳代，更換培養液。

1.2.2 NAFLD實驗分組 取對數生長期的細胞1×105/ml種植到6孔板，并孵育24h后，實驗分為正常組、模型組、低劑量組（HLF 100μg/ml）和高劑量組（HLF 400μg/ml），每組4瓶細胞。正常組用MEM培養液換液，而模型組、低劑量組和高劑量組，換液時換成含有1mmol/L，FFA 混合物（OA∶PA=2∶1） 的 10%FBS 的MEM培養液誘導。實驗重復5次，每組4個培養瓶。誘導24、48、72h后收集細胞，分別進行油紅O染色、顯微鏡觀察、計算細胞活力和TG測定等，確定細胞模型。

1.2.3 細胞形態學觀察 不同劑量HLF作用L-02細胞共48h，顯微鏡下觀察正常組、模型組、低劑量組、高劑量組的細胞形態學變化。

1.2.4 細胞凋亡檢測 采用Annexin V和PI雙染的方法檢測凋亡細胞。不同濃度HLF作用于L-02細胞48h后，用0.25%胰酶消化并收集細胞。1 500 r/min離心5 min，4℃，細胞用PBS洗2次，棄上清液，細胞在4℃下的稀釋結合液中重懸。取Annexin V-FITC溶液5 μl和PI 2.5 μl加到 100 μl細胞懸液中，混勻，避光，在冰水中孵育10 min。加稀釋的結合液400 μl到細胞懸液中混勻后上流式細胞儀檢測，于激發波長488 nm處測定細胞凋亡率，并采用CellQuest流式軟件分析。

1.2.5 凋亡蛋白表達檢測 不同濃度HLF作用于L-02細胞48h后，用0.25%胰酶消化收集細胞。Western blot法檢測 Bcl-2、Bax、Caspase-9及 Cytochrome C 蛋白表達。采用 mitochondria/cytosol fractionation kit（Bio－Vision,Mountain View,CA）試劑盒說明書將線粒體及細胞溶質分開。提取蛋白后采用12%SDS-PAGE膠分離蛋白條帶，然后轉移到PVDF膜。膜采用含5%脫脂牛奶的 TBST 液[10 mmol/L Tris-HCl（pH7.5），150 mmol/L氧化鈉和 0.05%Tween-20]封閉，分別采用Bcl-2（1：1 000），Bax（1：1 000），Caspase-9（1：1000），Cytochrome C（1：1 000）和 β-actin（1：1 000）抗體過夜。用辣根過氧化物酶標記的羊抗兔（1：2 000）或羊抗鼠（1：2 000）二抗孵育1 h，過氧化物酶的活力被采用ECL顯影的方法檢測條帶。采用凝膠成像儀上機檢測，并用Quantity One軟件定量分析。

1.3 統計學處理 應用SPSS 19.0統計軟件，計量資料均以表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊者組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，方差不齊者組間兩兩比較用Tamhane′s T2法檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞凋亡形態學變化 不同濃度HLF作用NAFLD的模型細胞48h，倒置顯微鏡下觀察凋亡細胞形態學改變。在FFA作用于細胞后，部分細胞生長被抑制，HLF藥物干預后，細胞凋亡明顯被抑制。在造模過程中，細胞在FFA的作用下生長受到抑制，細胞的變化主要表現為：細胞體積變小，分散排列，核漿比例降低，細胞膜皺縮起泡，細胞界限表現褶皺和濃染，細胞質出現透明空泡，呈輻射狀，葉狀突起。進一步發展，出現細胞膜出泡和凋亡小體形成。細胞體積明顯變小，細胞間隙明顯增大，邊界更清晰，凋亡形態也更加明顯。通過HLF藥物干預，隨著濃度的增加，L-02細胞形態改變明顯好于低劑量組及模型組。詳見圖1（見插頁）。

2.2 NAFLD細胞的凋亡率 Annexin V-FITC標記凋亡細胞，而PI標記壞死和中晚期凋亡細胞。Annexin VFITC代表水平軸的綠色熒光強度，PI代表垂直軸的紅色熒光強度。不同濃度HLF作用NAFLD細胞48h，隨著HLF濃度的增加，早期和總的凋亡率較未干預的模型組明顯好轉，且與濃度增高相關，詳見圖2。模型組與正常組相比較，細胞總凋亡率明顯增高，兩者比較差異有統計學意義（P＜0.01）；經過HLF干預后，模型組與高劑量組比較，早期凋亡率有統計學意義（P＜0.05），中晚期及總凋亡率有統計學意義（P＜0.01）。低劑量組與高劑量組相比較，中晚期凋亡率有統計學意義（P＜0.05），詳見表1。

2.3 NAFLD細胞凋亡蛋白的表達 隨著HLF作用濃度的增加，Bax、Cytosolic Cytochrome C蛋白表達水平逐漸降低，且Cleaved Caspase-9的活化也減少。然而，隨著 HLF作用濃度的增加，Bcl-2、Mitochondria Cytochrome C蛋白表達水平逐漸增加。詳見圖3。不同濃度HLF作用時，Bax/Bcl-2的比值，與模型組比較，高、低劑量組均有統計學意義（P＜0.01），高、低劑量組之間比較有統計學差異（P＜0.01）；Cytosolic/Mitochondria Cytochrome C的比值，與模型組比較，高、低劑量組均有統計學意義（均P＜0.01），高、低劑量組之間比較有統計學差異（P＜0.05）；Cleaved Caspase-9蛋白的表達，與模型組比較，高、低劑量組均有統計學意義（P＜0.01），高、低劑量組之間比較無統計學差異（P＞0.01），詳見表 2。

圖1 不同濃度HLF作用NAFLD細胞模型48h時倒置顯微鏡下檢測形態學改變（×400）

圖2 Annexin V-FITC/PI雙染檢測不同濃度HLF作用后NAFLD細胞的凋亡率（a區：機械損傷細胞，Annexin V-/PI+；b區：中晚期凋亡和壞死細胞，Annexin V+/PI+；c區：早期凋亡細胞，Annexin V+/PI-；d 區：正常活細胞，Annexin V-/PI-；b+c：總凋亡細胞）

表1 各組細胞凋亡率的比較（%）

圖3 Western blot法檢測不同濃度HLF作用于NAFLD細胞48h時 細 胞 的 Bax、Bcl-2、Mitochondria Cytochrome C、Cytosolic Cytochrome C及Cleaved Caspase-9的蛋白表達水平

3 討論

NAFLD的發病目前認為與脂肪酸的代謝異常、胰島素抵抗、細胞的氧化應激、肝細胞的凋亡等方面密切相關。隨著對線粒體功能的深入研究，線粒體在細胞凋亡中起著關鍵作用[9-10]。

表2 各組細胞凋亡蛋白表達水平的比較

細胞凋亡被分為外源性死亡受體通路和內源性線粒體通路[11-12]。在內源性凋亡途徑中，Bcl-2家族改變線粒體膜電位進而打開線粒體孔道，導致線粒體中的細胞色素C（Cytochrome C）大量釋放，細胞質中增多的Cyt-C（Cytosolic Cyto-chrome C）與ATP和凋亡蛋白酶激活因子（Apaf-1）共同作用，激活了 Caspase-9、Caspase-3和PARP，誘導了細胞凋亡。在線粒體調控凋亡的系統中，Bcl-2及其家族構成一個復雜且相互作用的調控細胞凋亡的網絡[13-15]。在NAFLD的形成過程中，Bcl-2和Bax扮演著重要的角色，脂肪變性和氧化應激使得Bax的合成和轉移到線粒體外膜的Bax增加，導致線粒體膜構型的改變，PT孔開放、細胞色素C的釋放，引起細胞的凋亡；Bcl-2主要分布于線粒體外膜，其同源二聚體抑制PT孔開放，且能與Bax結合，阻止Bax的構型變化而起到抗凋亡的作用[16-19]。Cyt-C和Caspase-9均為促凋亡蛋白。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，Bax屬于促凋亡蛋白。兩者的比值決定了細胞對凋亡的敏感性甚至可喻為細胞“凋亡開關”[20]。

本實驗在顯微鏡下觀察NAFLD細胞模型的凋亡形態，發現在FFA作用細胞后，模型組細胞生長被抑制，部分細胞可見凋亡；在不同濃度HLF作用后，肝細胞形態學改變有一定程度的好轉。運用Annexin VFITC/PI雙染檢測NAFLD細胞的凋亡率，可見模型組細胞的凋亡率與正常組相比明顯增高，兩者比較有統計學差異（P＜0.01）；經過不同濃度HLF干預后，隨著HLF作用濃度的增加，早期和總的凋亡率較未干預的模型組明顯好轉，隨著濃度增高細胞凋亡率明顯下降，模型組與高劑量組比較，早期凋亡率有統計學差異（P＜0.05），在中晚期及總凋亡率比較有統計學差異（P＜0.01）。低劑量組與高劑量組相比較，早期凋亡率及總凋亡率比較無統計學差異，中晚期凋亡率比較有統計學差異（P＜0.05）。本研究顯示NAFLD肝細胞在FFA作用細胞后，模型組細胞有明顯的形態學改變，存在生長被抑制、出現凋亡小體，通過HLF干預后，形態學改變有明顯好轉，肝細胞的凋亡率有明顯降低且與藥物濃度有關，差異有統計學意義。

運用Western blot檢測蛋白表達的結果表明，與凋亡密切相關的 Bax蛋白、Cytosolic Cytochrome C、Cleaved Caspase-9在NAFLD肝細胞模型中的表達均較正常組增加，而NAFLD細胞模型組中Bcl-2蛋白、Mitochondria Cytochrome C蛋白表達水平明顯低于正常組。經過HLF干預后，隨著HLF濃度的增加Bcl-2蛋白、Mitochondria Cytochrome C蛋白表達水平較模型組也逐漸增加,而 Bax蛋白、Cytosolic Cytochrome C、Cleaved Caspase-9相應減少。本研究還表明，模型組Bax/Bcl-2、CytosolicCytochromeC/MitochondriaCytochrome c的比值、Cleaved Caspase-9蛋白表達均較正常組升高，兩組比較有統計學差異（P＜0.01）；運用高、低濃度HLF作用NAFLD肝細胞時，Bax/Bcl-2、Cytosolic Cytochrome c/Mitochondria Cytochrome C的比值，Cleaved Caspase-9蛋白的表達均有不同程度下降，與模型組相比較，HLF高、低劑量組有統計學差異（P＜0.05）。降低Bax/Bcl-2和Cytosolic Cytochrome C/Mitochondria Cytochrome C比值的作用，高、低劑量組之間比較有統計學差異（P＜0.05或 0.01）；降低Cleaved Caspase-9凋亡蛋白表達的作用，高、低劑量組之間比較無統計學差異（P ＞0.05）。

結合文獻報道，Bcl-2、Bax、Cytochrome C、Cleaved Caspase-9均與細胞內源性凋亡相關，本實驗結果表明，HLF對NAFLD細胞凋亡的影響可能是通過調節線粒體 Bcl-2、Bax、Cytochrome C、Cleaved Caspase-9 等相關凋亡蛋白的表達，穩定線粒體功能而實現調控肝細胞的凋亡。通過調節肝細胞線粒體的功能來延緩或阻止NAFLD的進展，為臨床治療NAFLD提供了又一條思路。

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