高三尖杉酯堿聯合JQ1對急性髓系白血病細胞株Kasumi-1、Mv4-11的凋亡誘導作用

樂靜 李楓林 牧啟田 袁嬌嬌 裴仁治 金潔 陸瀅

高三尖杉酯堿（Homoharringtonine，HHT）是從我國植物三尖衫中提取的一種具有細胞毒性的生物堿，目前在國內是治療急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）的常規藥物之一，其中HHT聯合阿克拉霉素、阿糖胞苷的HAA方案是治療中青年AML的一線治療方案[1]。近年來有學者發現HHT聯合不同藥物可以對特定的AML細胞株發揮協同抑制作用，例如HHT聯合FLT3-ITD抑制劑索拉菲尼可以協同抑制FLT3-ITD突變的AML細胞株[2]。JQ1是近年來合成的靶向表觀遺傳蛋白BRD4的小分子抑制劑，它具有廣泛的抗AML作用[3]。本研究觀察HHT聯合JQ1對AML細胞株的殺傷作用，以探討HHT聯合JQ1治療AML的可行性，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及儀器 AML細胞株Kasumi-1及Mv4-11（由浙江大學醫學院附屬第一醫院饋贈），Gibco FBS的IMDM培養基及1640培養基（美國Hyclone公司），HHT、JQ1（美國 Sigma公司），MTS細胞增殖測試試劑盒（批號：0000282257，美國Progema公司），Annex－inV-FITC/PI凋亡測試試劑盒（批號：83001302，上海聯科生物公司），兔抗人 Gapdh、Bcl-2、Caspase-3，Parp 一抗及兔二抗（美國CST公司）。安全柜（型號：1374，美國Thermo公司），CO2培養箱（型號：3111，美國 Thermo公司），電熱恒溫水槽（型號：DK-8D，上海精宏公司），高速離心機（型號：Legend Micro17R，美國 Thermo公司），倒置生物顯微鏡（型號：CKX31，日本奧林巴斯公司），酶聯免疫檢測儀（型號：3001，美國Thermo公司），流式細胞儀（型號：FACS-Cantoll，美國BD公司），蛋白印記檢測系統（型號：ChemiDoc-MP，美國BioRad公司）。

1.2 細胞培養 將Mv4-11細胞株培養在含10%FBS的IMDN培養液中，Kasumi-1細胞培養在含10%FBS的 1640 培養液中，在 37℃、75%N2、5%CO2、20%O2的環境中培養，待細胞進入對數生長期進行實驗。

1.3 MTS法檢測單藥及兩藥聯合對AML細胞株的抑制作用 （1）單藥細胞毒性實驗：Mv4-11、Kasumi-1細胞鋪24孔板，細胞鋪板密度為1.0×105/ml。鋪板48h后移板至96孔板，加入20μl MTS，4h后用酶標儀檢測490nm 的 OD 值 。 HHT 濃 度 采 用 1、2、4、8、16、32、64nmol/L，JQ1 濃度采用 50、100、200、400、800nmol/L。細胞存活率=（用藥組OD值-空培養基OD值）/（對照組OD值-空培養基OD值）×100%，根據公式計算各個濃度作用72h的細胞存活率。利用Graphpad Prism軟件計算 HHT、JQ1 對 AML 細胞株的半數抑制濃度（IC50）。（2）兩藥聯合細胞毒性實驗：根據HHT及JQ1單藥的IC50，對于 Mv4-11 細胞，HHT 濃度采用 2、4、8nmol/L，分別與100、200、400nmol/L 的 JQ1聯合；對于 Kasumi-1細胞，HHT 濃度采用 5、10、15、20nmol/L，分別與 100、200、300、400nmol/L的JQ1聯合。細胞鋪板密度為1.0×105/ml，鋪板72h后移板至96孔板，加入20μl MTS，4h后用酶標儀檢測490nm的OD值。根據上述細胞存活率公式，計算兩藥聯合作用72h的細胞存活率。（3）細胞增殖實驗：Mv4-11、Kasumi-1細胞鋪96孔板，細胞鋪板密度為5.0×103/100μl，鋪板 0、24、48、72、96h，加入 20μl MTS，4h后用酶標儀測490nm的OD值。所有實驗重復3次，取平均OD值。對于Mv4-11細胞，HHT濃度采用4nmol/L，與200nmol/L的JQ1聯合；設置空白對照組、HHT組、JQ1組、兩藥聯合組。對于Kasumi-1細胞，HHT濃度采用15nmol/L，與300nmol/L的JQ1聯合；設置空白對照組、HHT組、JQ1組、兩藥聯合組。細胞增殖倍數=每個時間點OD值/0h的OD值，根據公式計算每組各個時間點的細胞增殖倍數，同時利用Graphpad Prism軟件描繪細胞生長曲線。

1.4 流式細胞儀檢測兩藥聯合對AML細胞株凋亡的作用 Mv4-11細胞的HHT濃度采用4nmol/L，JQ1濃度采用200nmol/L；Kasumi-1細胞的HHT濃度采用15nmol/L，JQ1濃度采用300nmol/L，鋪板6孔板，細胞鋪板密度為 1.0×105/ml；培養 48h 后，1 500r/5min 離心，收集細胞團塊。用冷的PBS洗細胞團塊2次，加入500μl Binging Buffer懸浮細胞，再加入5μl AnnexinV-FITC和10μl PI混勻，室溫避光15min。1h內用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗重復3次，取平均值。

1.5 Western blot法檢測兩藥聯合對凋亡相關蛋白的作用 Mv4-11細胞HHT濃度采用4nmol/L，JQ1濃度采用 200nmol/L；Kasumi-1細胞的 HHT濃度采用15nmol/L，JQ1濃度采用300nmol/L。鋪板6孔板，細胞鋪板密度為1.0×105/ml；培養48h后，1 500r/5min離心，收集細胞團塊。加入RIPA裂解液充分裂解細胞團塊，冰上孵育30min，12 000r/15min離心，取上清液于EP管。采用BCA法檢測蛋白濃度，蛋白上樣量為40μg。SDS-PAGE凝膠電泳后PVDF膜轉膜，1∶1 000過夜孵育一抗，1∶5 000孵育辣根過氧化物酶二抗，顯色并用BIO-RAD凝膠成像系統采集并分析數據。

1.6 統計學處理 應用Graphpad Prism統計軟件。計量資料用表示，組間比較采用t檢驗；計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HHT、JQ1單藥及兩藥聯合作用AML細胞株的存活率 不同濃度HHT及JQ1處理AML細胞株Mv4-11、Kasumi-1后，證實兩藥聯合對AML細胞株有生長抑制作用。HHT、JQ1作用Mv4-11細胞的IC50分別為7.2（95%CI：5.6~9.2）、345.7（95%CI：333.2~358.6）nmol/L，作用Kasumi-1細胞的IC50分別為22.3（95%CI：20.75~23.94）、356.9（95%CI：338.0~374.9）nmol/L。對于 Mv4-11細胞，4nmol/L的HHT、200nmol/L的JQ1單藥及兩藥聯合作用72h的細胞存活率分別為62.5%、93.1%和42.4%，差異有統計學意義（P＜0.05）；8nmol/L的 HHT、400nmol/L的JQ1單藥及兩藥聯合作用72h的細胞存活率分別為24.0%、62.1%和8.8%，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1a。對于Kasumi-1細胞，5nmol/L的HHT、100nmol/L的JQ1單藥及兩藥聯合作用72h的細胞存活率分別為97.0%、113.3%和44.4%，差異有統計學意義（P＜0.05）；10nmol/L的 HHT、200nmol/L的 JQ1單藥及兩藥聯合作用72h的細胞存活率分別為55.0%、108.0%和26.3%，差異有統計學意義（P＜0.05）；15nmol/L的HHT、300nmol/L的JQ1單藥及兩藥聯合作用72h的細胞存活率分別為33.2%、95.6%和15.0%，差異有統計學意義（P＜0.05）；20nmol/L 的 HHT、400nmol/L 的JQ1單藥及兩藥聯合作用72h的細胞存活率分別為25.1%、62.5%和9.0%，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1b。

圖1 HHT、JQ1單藥及兩藥聯合作用AML細胞株的存活率（a：2、4、8nmol/L的HHT與100、200、400nmol/L的JQ1單藥及兩藥聯合作用 Mv4-11 細胞 72h 的存活率；b：5、10、15、20nmol/L 的 HHT 與 100、200、300、400nmol/L 的 JQ1 單藥及兩藥聯合作用 Kasumi-1 細胞72h的存活率）

2.2 HHT、JQ1單藥及兩藥聯合對AML細胞株增殖的抑制作用 進一步選擇4nmol/L的HHT、200nmol/L的JQ1單藥及兩藥聯合作用Mv4-11細胞，15nmol/L的HHT、300nmol/L的JQ1單藥及兩藥聯合作用Kasumi-1細胞，以觀察單藥及兩藥聯合對AML細胞株增殖的抑制作用。生長曲線顯示HHT聯合JQ1作用于2個細胞系后，細胞生長速度明顯慢于單藥作用（均P＜0.05），見圖2。

圖2 HHT、JQ1單藥及兩藥聯合對AML細胞株增殖的抑制作用（a：4nmol/L的HHT、200nmol/L的JQ1單藥及兩藥聯合對Mv4-11細胞增殖的抑制作用；b：15nmol/L的HHT、300nmol/L的JQ1單藥及兩藥聯合對Kasumi-1細胞增殖的抑制作用）

2.3 HHT、JQ1單藥及兩藥聯合對AML細胞株凋亡的誘導作用 對于Mv4-11細胞，4nmol/L的HHT、200nmol/L的JQ1單藥及兩藥聯合作用后，細胞凋亡率分別為27.7%、12.8%和59.6%，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3ab。對于Kasumi-1細胞，15nmol/L的HHT、300nmol/L的JQ1單藥及兩藥聯合作用后，細胞凋亡分別為9.1%、8.5%和31.2%，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3c-d。

2.4 HHT、JQ1單藥及兩藥聯合對AML細胞株凋亡相關蛋白表達的影響 由于HHT聯合JQ1可以明顯誘導AML細胞株的凋亡，筆者應用Western blot法檢測了凋亡相關蛋白表達。對于Mv4-11細胞，4nmol/L的HHT、200nmol/L的JQ1兩藥聯合較單藥能明顯抑制Bcl-2蛋白表達，促進Caspase-3蛋白表達，見圖4a。對于Kasumi-1細胞，15nmol/L的 HHT、300nmol/L的 JQ1兩藥聯合較單藥能明顯抑制Bcl-2蛋白表達，促進Parp的降解而出現裂解條帶，見圖4b。

3 討論

圖3 HHT、JQ1單藥及兩藥聯合對AML細胞株凋亡的誘導作用（a-b：4nmol/L的HHT、200nmol/L的JQ1單藥及兩藥聯合對Mv4-11細胞凋亡的誘導作用；c-d：15nmol/L的HHT、300nmol/L的JQ1單藥及兩藥聯合對Kasumi-1細胞凋亡的誘導作用）

在我國，HHT用于治療AML已有20余年歷史。目前HAA方案作為＜60歲患者一線治療方案而寫入中國AML患者診療指南，同時作為候選治療方案而寫入復發難治的AML患者診療指南中[1，4-5]。以HHT為基礎藥物聯合經典及新型的小分子抑制劑對AML患者的療效是近年來研究的方向，以探索AML治療的新方案。JQ1是表觀遺傳蛋白BRD4的靶向抑制劑，單藥對白血病干、祖細胞及多種AML細胞株具有明顯的抑制作用[3]。本文通過研究HHT聯合JQ1對AML細胞株的作用，以探索HHT聯合JQ1的可行性。

BRD4是近年來發現的BET家族的一員。研究表明BET蛋白家族可能與一些疾病通路相關，因此認為其可作為潛在的藥物治療靶點，其中最顯著的是BRD4[6]。JQ1是靶向BRD4的新合成的小分子抑制劑，最早由Filippakopoulos研究小組合成并應用于人鱗狀細胞癌，結果顯示JQ1通過與溴結構域競爭性結合而抑制BRD4與組蛋白乙酰化賴氨酸殘基的結合，促進鱗狀細胞癌的分化并顯示特殊的抗增殖作用[7]。進一步研究表明，JQ1對血液系統惡性腫瘤多發性骨髓瘤（MM）[8]、非霍奇金淋巴瘤[9]、急性淋巴細胞白血病[10]具有抑制作用。Zuber等[11]用RNAi干擾的方法證實了BRD4抑制在AML中可作為治療靶點；體外實驗結果顯示白血病干、祖細胞及多種AML細胞株對JQ1敏感，可引起白血病細胞的生長抑制及凋亡，雖然對正常骨髓細胞株也有一定的抑制，但相較于AML細胞株需要更高的IC50值；同時發現HHT聯合阿糖胞苷可以發揮協同抗AML細胞株的作用。本研究結果也驗證了JQ1對AML細胞株Mv4-11及Kasumi-1均有明顯抑制作用，但是目前并無相關文獻研究JQ1聯合HHT對AML細胞株的作用。

圖4 HHT、JQ1單藥及兩藥聯合對AML細胞株凋亡相關蛋白表達的影響（a：4nmol/L的HHT、200nmol/L的JQ1單藥及兩藥聯合作用Mv4-11細胞48h對Bcl-2、Caspase-3蛋白表達的影響；15nmol/L的HHT、300nmol/L的JQ1單藥及兩藥聯合作用Kasumi-1細胞48h對Bcl-2、Parp蛋白表達的影響）

本研究結果發現，HHT聯合JQ1對AML細胞株的抑制作用明顯強于單藥，且兩藥聯合可以明顯抑制AML細胞株的生長；提示HHT聯合JQ1是治療AML的可行方案。本文進一步探索HHT聯合JQ1對AML細胞株凋亡的作用，結果表明HHT聯合JQ1對AML細胞株凋亡的誘導作用明顯強于單藥，Western blot檢測又發現HHT聯合JQ1相較于單藥可以明顯抑制Bcl-2蛋白表達，并激活Caspase-3蛋白表達，引起Parp的裂解。Bcl-2是凋亡途徑中重要的凋亡抑制因子，細胞發生凋亡可以抑制其表達水平，且細胞在發生凋亡時伴隨Caspase-3的激活并引起Parp的降解，從而促進細胞的凋亡[12]。

綜上所述，HHT聯合JQ1可以增強抗AML細胞株的作用，促進AML細胞株的凋亡，是有效的聯合方案。但具體作用機制及臨床應用的可行性有待進一步研究。

4 參考文獻

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