液氮緩慢冷凍方法對精液冷凍復蘇后精子活力的影響

董世桃

【摘要】 目的：研究和分析快速冷凍方法對精液冷凍復蘇后精子活力的影響。方法：從2013年7月-2016年7月所有收集到的精液標本中選取其中的150例精液標本作為本次的試驗研究對象，將這150例精液標本按照不同的冷凍方法分為觀察組和對照組兩組，各75例，對照組采用快速冷凍法進行精液冷凍，觀察組采用液氮緩慢冷凍法進行冷凍，冷凍時間超過24 h，觀察和分析兩組精液標本冷凍前后前向運動（PR）精子數量、精子存活率、精子畸形率，對比兩組精子冷凍后復蘇率和平均精子活力指數。結果：冷凍前，兩組精液PR精子數量、精子存活率、精子畸形率、平均精子活力指數比較差異無統計學意義（P>0.05）；冷凍后，快速冷凍方法的精液冷凍復蘇后PR精子數量、精子存活率、精子復蘇率和平均精子活力指數均顯著低于液氮緩慢冷凍復蘇后PR精子數量、精子存活率、精子復蘇率和平均精子活力指數，差異均有統計學意義（P<0.05）。結論：采用液氮緩慢冷凍法進行精液冷凍會顯著提高精液冷凍復蘇后的精子前向運動精子數量、精子存活率、精子復蘇率和平均精子活力指數，適合在精液冷凍當中應用。

【關鍵詞】 精液； 精子活力； 精子冷凍復蘇率； 液氮緩慢冷凍方法

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2018.7.078 文獻標識碼 B 文章編號 1674-6805（2018）07-0162-03

精子凍融技術是人類精子庫和輔助生殖技術當中的其中一項核心技術，隨著近幾年來精子凍融技術的不斷發展，精子冷凍的方法越來越多[1]。為了給臨床實驗提供相關方面的研究依據，本文對液氮緩慢冷凍方法對精液冷凍復蘇后精子活力的影響進行簡要的探究和分析[2]。具體如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

從2013年7月-2016年7月所有收集到的精液標本中選取其中的150例精液標本作為本次的試驗研究對象，這150例精液標本均得到本人的知情同意，這150例捐精志愿者年齡23～36歲，平均（29.37±7.63）歲，這150例捐精者均在取精前禁欲2～7 d，精液量2～5 ml，并且在15 min內將精液完全液化，將這150例精液標本按照不同的冷凍方法分為觀察組和對照組兩組，各75例。所有精液標本在冷凍前的精子數都≥15×106/ml，正常形態的精子≥4%，前項運動PR精子數≥32%。兩組精液標本精液量、冷凍時間、冷凍前精子濃度、冷凍劑的使用、PR精子數和正常形態精子、捐精者年齡等方面比較差異均無統計學意義（P>0.05），可對比。

1.2 冷凍試劑

本次精液冷凍所選的冷凍保護劑是GYC型冷凍保護劑，這種冷凍保護劑的成分包括5%葡萄糖溶液37.4 ml，2.9%枸櫞酸鈉溶液58.6 ml，甘油56.0 ml，蛋黃48 ml，pH值為7.2的慶大霉素0.5 ml，精液與冷凍劑的比例為3：1[3]。

1.3 方法

1.3.1 精液的冷凍方法 按照精液與冷凍劑的比例將加入同一精子冷凍培養基的精液裝入凍存管中，并保證培養基和精子細胞能夠混合并保持徹底平衡，然后將凍存管卡在金屬桿的夾子上，將凍存管分為兩組，分別根據快速冷凍法和液氮緩慢冷凍法進行冷凍，其中快速冷凍法是將凍存管直接浸入溫度為零下195 ℃的液氮罐當中；液氮緩慢冷凍法是先將凍存管放置到溫度為4 ℃的冰箱中，放置時間為5～10 min，將其取出后放置到液氮蒸汽當中熏10 min，然后再從液氮蒸汽中取出凍存管將其浸入到零下196 ℃的液氮罐中[4]。兩組精液的冷凍時間要超過24 h。

1.3.2 精子的解凍方法 將凍存管從冰箱中取出，并將取出的凍存管從35 ℃的水溫中進行水浴，直至凍存管完全溶解。把解凍后精子溶液倒入事先準備好的試管當中，然后緩慢的以一滴一滴的方式將三份精子沖洗培養基和精子溶液進行徹底的混合，確保精子冷凍培養基能夠被完全稀釋，需要注意的是這一操作要在30 s內完成[5]。然后取300 g精子溶液進行持續10 min離心后，將上面的清水棄除掉后，再加入適量的精子沖洗培養基，直到試管內的精子溶液大約為0.5 ml，進行精子的重懸，然后對精液進行分析，并檢測前向運動（PR）精子濃度、精子復蘇率和平均精子活力[6]。

1.4 觀察指標及評價標準

本次對精液的分析根據《世界衛生組織WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊》第五版中的相關規程進行精液的常規分析和精子形態學的分析，觀察和分析的內容包括精液量、前向運動（PR）精子濃度、精子復蘇率和平均精子活力[7-8]。精子存活率分析方法：將20μl的精液標本和5 g/L的伊紅Y溶液按照1：1的比例混合均勻后，覆蓋上蓋玻片，靜置30 s后采用400倍的光學顯微鏡進行觀察，其中活精子不著色，死細胞為紅色[9]。精子冷凍復蘇率=冷凍后PR精子百分率/冷凍前PR精子百分率。平均精子活力指數=（復蘇后的精子活力數/初始精液精子活力數）×100%。

1.5 統計學處理

本文所有數據用 SPSS 13.0 統計軟件分析處理，計量資料以（x±s）表示，并采用 t 檢驗，計數資料以率（%）表示，采用字2檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 冷凍前兩組精液精子活力情況比較

冷凍前，兩組精液PR精子數量、精子存活率、精子畸形率、平均精子活力指數比較差異無統計學意義（P>0.05），見表1。

2.2 冷凍后兩組精液精子活力情況比較

冷凍后，快速冷凍方法精液冷凍復蘇后PR精子數量、精子存活率、精子復蘇率和平均精子活力指數均顯著低于液氮緩慢冷凍法精液精子冷凍復蘇后PR精子數量、精子存活率、精子復蘇率和平均精子活力指數，差異均有統計學意義（P<0.05），見表2。

3 討論

精液冷凍和輔助生殖技術是不孕不育患者的福音，截至目前，精子庫的建立和供精人工授精已經被廣泛應用，使得精子具有長期保存、可以隨時取用，同時有效保證了剩余保險等[10]。

雖然近幾年來隨著醫療技術和醫療衛生事業的不斷發展，精液冷凍技術得到快速的發展，已經有越來越多不同的精液冷凍方法，但是對于冷凍前后精液精子的活動力情況，有相關人員和專家對其進行了多方面的實驗研究，有大量的實驗研究結果和文獻資料表明，精液冷凍復蘇后的精子活動力就與精液的冷凍方法有一定的關系[11]。

在精子冷凍保存的過程當中，精子不可避免地會受到一些物理和化學效應的影響，精子冷凍的損傷機制中，與精子冷凍時膜流動性和完整性有關，與氧化壓力的大小有關，與降溫、復蘇過程中冰晶形成后的機械損傷有關。有關研究證實，在精子冷凍的過程當中，快速降溫會導致精子細胞內形成冰晶，而緩慢冷凍所形成的冰晶在細胞外，兩者相比，細胞內冰晶對精子造成的損傷明顯高出許多，從這一方面來看，液氮緩慢冷凍法對精液冷凍復蘇后精子活動力的影響明顯會小很多。

本文對精液液氮緩慢冷凍法冷凍復蘇后精子的活動力情況進行了簡要的分析和研究，從上述結果中可以看出，液氮緩慢冷凍法冷凍復蘇后的精子前向運動（PR）精子數量、精子存活率、精子復蘇率和平均精子活力指數等與液氮快速冷凍相比，會顯著增強和提高，值得在精液冷凍當中推廣應用[12]。

參考文獻

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（收稿日期：2017-08-29）