厚唇魚CO1基因與CYTB基因克隆與結構特征分析

廖莉莉 謝永廣 陳敦學

線粒體作為一種磷脂雙分子層的細胞結構，存在于幾乎所有的真核生物中。同時線粒體作為真核生物主要的供能器官，不僅可以通過氧化磷酸化作用為真核生物提供超過95%的能量[1]，同時由于線粒體DNA的高進化速率和特殊的結構特征，線粒體DNA也被作為一種分析物種進化的有效工具[2]。

線粒體DNA在脊椎動物中，具有較為保守的結構，其基因組共包含13個編碼蛋白基因，2個rRNA基因，一個非編碼的控制區，此外還包含22個tRNA間隔分布在13個編碼蛋白基因之間。其分子量大約在16kb左右，由于缺乏自我修復系統以及母系遺傳特征，線粒體DNA被廣泛應用于系統進化分析及物種鑒定。CO1和CYTB基因往往被作為分析物種進化的有效工具而被廣泛使用。Chen（2010）利用線粒體16S rRNA基因，CO1基因，以及CYTB基因分析了鱖類遺傳分析[3]；柳淑芳（2010）利用CO1基因構建了石首魚科的條形碼，并進行了其系統分類研究[4]；彭居俐（2009）利用CO1基因進行了鯉科鲌屬魚類物種鑒定[5]；胡靜（2014）利用CO1和CYTB基因分析了南中國海不同海域波紋唇魚群體遺傳多樣性[6]；陳抒云（2015）利用CO1和CYTB基因進行了蟲草屬物種的寄主鑒定[7]。

自然狀態下，光唇魚廣泛分布在河流和小溪的礫石沉積物中。由于厚唇魚必須生長在優良水質中，因此厚唇魚又被認為是水環境的檢測者[8，9]。同時由于厚唇魚具有漂亮的體色，又被作為觀賞魚養殖，深受廣大消費者喜愛。目前有超過10種厚唇魚屬被鑒定與報道過[10]，厚唇魚（A. labiatus）作為厚唇魚屬的重要物種，卻很少被注意與研究，因此本研究擬以厚唇魚CO1和CYTB基因為依托，分析厚唇魚的進化特征。

1、材料與方法

1.1實驗材料、試劑及儀器

實驗所需厚唇魚來至貴州省凱里市，用無水乙醇浸泡保存備用，實驗所用生物試劑均為國產或者進口儀器，測序委托上海博尚生物有限公司完成。

1.2 基因組DNA的提取與鑒定

厚唇魚基因組的提取采用天根生物公司的基因組組提取試劑盒進行提取，同時采用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計測定吸光度確定濃度。

1.3 引物設計，PCR與數據分析

實驗采用同源克隆技術進行克隆，以厚唇魚屬的A. fasciatus和A. Parallens序列為參考，設計CO1與CYTB基因克隆引物，構建克隆載體并進行雙向測序分析，并對測序結果進行拼接與評價。

2、結果與分析

2.1 CO1與CYTB基因結構特征分析

將測序得到的序列進行拼接，去除重復序列，并在NCBI數據庫進行比對，發現厚唇魚CO1與CYTB基因分別長度為1551bp與1141bp，分別編碼516與380個氨基酸。其起始密碼子分別為GTG與ATG，終止密碼子分別為GAA和T--，其中CYTB出現了不完全終止密碼子。分析發現CO1與CYTB基因本身沒有特殊的A+T偏好性，然而，在第三位堿基上，其G堿基含量卻明顯偏低，分別為7.0和5.8，遠低于一般情況，此外，整個CO1基因與CYTB基因的G堿基含量都偏低（17.3和14.6）。這種情況在脊椎動物線粒體中是比較常見的現象。

在分析相近物種進化過程中，由于GC-skew在屬內或者相近物種中，具有較大變化，因此分析物種的GC-skew對分析物種的進化也具有重要作用[11]，因此本文分析了11種厚唇魚屬CO1和CYTB的GC-skew，結果顯示厚唇魚屬的GC-skew均呈現負值，且CYTB的GC-skew值明顯小于CO1，而分析其AT-skew時卻出現CO1為負值，CYTB為正值的情況，這與在全基因組上的結果不完全一致，脊椎動物全基因組一般都是CC-skew屬于負值，而AT-skew主要偏向正值，具體原因可能是由于線粒體各個編碼蛋白基因的進化速率不一樣造成的。

2.2基因CO1與CYTB的進化分析

為了研究厚唇魚屬的物種進化關系，我們利用MEGA4.0軟件，采用N-J分別構建的基因CO1和CYTB的進化樹，分析其進化關系，其中Spinibarbus sinensis和Onychostoma rara作為外群，結果顯示厚唇魚屬并沒有完全聚成一簇，其中CO1中，選用的外群全部并入了厚唇魚屬，而在CYTB中，外群Spinibarbus sinensis作為獨立的一支分化出來，而Onychostoma rara卻依舊和厚唇魚屬并在一起，以上結果顯示厚唇魚屬可能非單系起源。我們研究的厚唇魚的親緣關系確是確定的，首先是A. parallens 和A. Hemispinus聚成一支，然后在和我們的A.labiatus 進行聚合，這說明我們研究的厚唇魚為一個獨立的物種。

進化關系的準確性，與序列長短正相關，為了進一步闡明厚唇魚屬的物種進化關系，我們將所克隆得到的CO1基因與CYTB基因進行拼接后利用MEGA4.0軟件構建NJ進化樹分析，結果見圖三，結果與CYTB構建進化樹基本一樣，然而，對研究中的厚唇魚還是有少量差別，主要體現在小分支之間的差別。

3、討論

3.1線粒體基因進化的適用性分析

在系統進化分析中，由于不同的基因片段進化速率不一樣，選擇合適的區段進行分析一直是研究進化分析的難點，早期的研究中，受限于數據庫中數據量的限制，只能進行利用長片段進行高級階元的分析，例如Zardoya就選用了8種脊椎動物的線粒體基因組的高級階元的分析[12]。隨著數據庫數據量的增大，選擇一個或者幾個具有代表性的片段簡單快捷的分析物種的進化關系就顯得尤為重要了。早期研究中Zardoya認為CO1和CYTB具有很好的適用性，然而Miya卻認為CO1與CYTB不具有最好的適用性[13]。在本研究中，我們采用目前通用的CO1和CYTB進行進化分析。

3.2線粒體堿基組成與使用規則分析

線粒體基因具有較好的保守性，比較分析其堿基組成發現CO1基因與CYTB基因中，其G堿基含量都非常低，這與所報道的硬骨魚類線粒體基因組G堿基含量低是一致的。同時分析整個厚唇魚屬的AT-skew和GC-skew，發現其數值變化趨勢也基本一樣，且數值差別不大，這似乎可以證明厚唇魚屬分化時間還不長，彼此之前差別也不大，與進化分析結果一致的。

參考文獻：

[1]Shen YY， Shi P， Sun BY， et al. Relaxation of selectiveconstraints on avian mitochondrial DNA following thedegeneration of flight ability. Genome Res 2009； 19： 1760-1765.

[2]Chen D， Li Y， Li H， Wang K， Du S， Chu W， Zhang J. The genetic diversity ofsinipercid fishes based on complete mitochondrial DNA of six sinipercid fishesfrom different drainages in China. Curr Mol Med. 2014；14（10）：1279-85.

[3]Catanese G， Manchado M， Infante C. 2010. Evolutionaryrelatedness of mackerels of the genus Scomber based on complete mitochondrial genomes： Strong support to the recognition of Atlantic Scomber colias and Paci?c Scomber japonicus as distinct species. Gene 452（1）：35–43.

[4]柳淑芳，陳亮亮，戴芳群，莊志猛. 基于線粒體CO1基因的DNA條形碼在石首魚科（Sciaenidae）魚類系統分類中的應用[J]. 海洋與湖沼，2010，41（02）：223-232.

[5]彭居俐，王緒禎，王丁，何舜平. 基于線粒體CO1基因序列的DNA條形碼在鯉科鲌屬魚類物種鑒定中的應用[J]. 水生生物學報，2009，33（02）：271-276.

[6]胡靜，侯新遠，尹紹武，祝斐，賈一何，王小軍. 基于mtDNA COⅠ和Cytb基因序列對南中國海不同海域波紋唇魚群體遺傳多樣性的研究[J]. 水生生物學報，2014，38（06）： 1008-1016.

[7]陳抒云，曹樹萍，袁航，過立農，林羽，陳丹，鄭健，林瑞超. 線粒體COI和CYTB基因在蟲草屬物種寄主昆蟲鑒定中的適用性分析[J]. 世界科學技術-中醫藥現代化，2015， 17（01）：182-188.

[8]Liu GD， Sheng Z， Wang YF， Han YL， Zhou Y， Zhu JQ（2016） Glutathione peroxidase 1expression， malondialdehyde levels and histological alterations in the liver ofAcrossocheilus fasciatus exposed to cadmium chloride. Gene. 578（2）：210-218.

[9]ZhangYM， Yan JQ （2010） Observations on embryonic development of Acrossocheilusfasciatus. J Shaoxing Univ. 30， 44-48 （In Chinese）.

[10]Xie XY， Huang GF， Li YT， Zhang YT， Chen SX（2015） Complete mitochondrial genome ofAcrossocheilus parallens （Cypriniformes， Barbinae）. Mitochondrial DNA A DNA Mapp Seq Anal. 27（5）：3339-3340.

[11]Nesnidal MP， Helmkampf M， Bruchhaus I， Hausdorf B（2011） The complete mitochondrial genome of Flustra foliacea （Ectoprocta， Cheilostomata）-compositional biasaffects phylogenetic analyses of lophotrochozoan relationships. BMC Genomics.23；12：572.

[12]Zardoya R， Meyer A. The completeDNA sequence of the mitochondrial genome of a "livingfossil，" the coelacanth （Latimeriachalumnae）[J]. Genetics. 1997 Jul；146（3）：995-1010.

[13]Miya M， Takeshima H， Endo H， Ishiguro NB， Inoue JG. Major patterns of higher teleostean phylogenies： a new perspective based on 100 complete mitochondrial DNA sequences[J].Mol Phylogenet Evol. 2003 Jan；26（1）： 121-38.