乳腺癌組織中Dab1蛋白表達及其臨床相關性研究

王同玫，張一奇，文普帥，畢竟，李錦成

（1.錦州醫科大學附屬第一醫院 乳腺外科，遼寧 錦州 121001；2.錦州醫科大學病理生理教研室，遼寧 錦州 121001；3.錦州醫科大學 神經生物學實驗室，遼寧 錦州 121001）

目前，乳腺癌已成為女性最常見的惡性腫瘤之一，也是引起女性死亡的重要病因。最新數據顯示，每年全世界女性乳腺癌發病率為167萬，其中發展中國家占52.9%[1]；在我國，乳腺癌發病率也逐年增多，且呈年輕化趨勢[2]。因乳腺癌的早期臨床癥狀不明顯，故多數患者首次診斷即已至中晚期。雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、抗細胞增殖核抗原（Ki-67）、抑癌基因p53、癌基因Her2/neu等分子標志物的相繼發現，在一定程度上闡釋了乳腺癌的發病機制，也為其精準治療提供候選靶點。但由于腫瘤的異質性，仍需進一步探究在乳腺癌發生發展中發揮關鍵作用的相關分子。

Disabled-1（Dab1）是細胞內重要的銜接蛋白，由555個氨基酸組成，N端有蛋白相互作用/磷酸酪氨酸結合的結構域P（I/PTB domain），可結合多個含NPxY的跨膜蛋白[3]，其基因位于染色體1p32.2的不穩定區域，也就是基因修飾活躍和缺失區域；研究表明，在人類的腫瘤中Dab1低表達的情況并不少見，其異常表達于子宮內膜癌，腦膠質瘤中[4]。最近國內學者發現[5]，該基因在乳腺癌細胞中表達降低，故推測該基因可能與乳腺癌發生、發展有關，但有關該基因是如何在乳腺癌的發生、發展中起作用及其與乳腺癌患者的臨床病理特征的關系，尚未見相關報道。本研究通過免疫組織化學（簡稱免疫組化）檢測乳腺癌組織中Dab1的表達水平，并分析其與患者臨床病理特征的關系，從而為后續探究Dab1及其相關信號通路在乳腺癌中的生物學作用奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年10月-2017年5月本院手術切除后經病理診斷確診為乳腺癌的50例石蠟包埋癌組織標本。其中導管原位癌19例，浸潤性導管癌15例，黏液性癌4例，浸潤性小葉癌3例，混合性（導管內癌及小葉癌）9例；均為女性；年齡35～65歲。同時取50例距其癌組織3 cm的癌旁組織作對照。以上所用標本均經10%的中性甲醛固定石蠟包埋，所有患者在術前均未進行放療、化療及免疫治療。

1.2 試劑與設備

一抗兔抗人Dab1抗體購自Millipore公司，用于免疫組化的濃度為1∶100～1∶2 000，本實驗選擇的濃度為1∶200；免疫組化試劑盒以及DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。正置顯微鏡（德國Leica公司，4000b），超純水機（美國Millipore公司，Milli-Q Integral 3），高壓滅菌器（日本SANYO 公司，MLS-3780），溫箱（Thermo Scientific），不銹鋼高壓鍋。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化染色 采用免疫組化SP法，嚴格按照說明書進行操作。主要步驟：每例標本取3張切片常規二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化；3%過氧化氫室溫孵育10 min消除內源性過氧化物酶的干擾，雙蒸水洗3次；檸檬酸緩沖液（pH 6.0）高壓抗原修復，待切片自然冷卻至室溫，PBS洗3次；滴加山羊血清室溫封閉15 min；去除血清滴加Dab1一抗（用PBS稀釋比例為1∶200），濕盒中4℃冰箱過夜；取出過夜的切片恢復室溫，用PBS洗3次，滴加生物素標記二抗，37℃孵育15 min，PBS洗3次；滴加辣根酶標記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育15 min，PBS洗3次；DAB顯色，顯微鏡下觀察顯色反應，若切片中發現棕黃色顯色立即自來水沖洗終止反應；顯色后的切片蘇木精復染5 min，1%濃鹽酸無水乙醇分化返藍，梯度酒精脫水、二甲苯透明后中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察并判斷結果。

1.3.2 免疫組化染色陽性結果判定標準 Dab1表達主要為細胞核內黃褐色沉淀，根據免疫組化反應結果判斷標準進行評分[6]。首先將染色強度進行評分：無色0分、淡黃色1分、棕黃色2分、黃褐色3分；再對陽性細胞所占百分比進行評分：顯微鏡下選5個視野先低倍后高倍進行觀察，每個視野計數100個細胞，算出5個視野陽性細胞所占百分比，然后進行評分：陰性0分，陽性細胞≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。最后將每張切片兩種評分相乘為其染色分數：0分為陰性，1～3分為弱陽性，4～6分為陽性，＞8分為強陽性。為方便統計，陽性和強陽性判定為陽性表達；其他的均定義為陰性表達。

1.3.3 相關數據庫乳腺癌樣本中Dab1表達水平及生存分析 在Oncomine數據庫中查詢Dab1表達譜，先限定（Analysis type：Breast cancer vs Normal analysis），再輸入基因名稱，即可檢索獲得各乳腺癌相關的數據集，P＜0.05的過濾選項；從GEO公共數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）尋找并下載乳腺癌基因芯片GSE45255和GSE26971數據。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 17.0統計軟件，計數資料以率（%）表示，采用χ2檢驗，Kaplan-Meier法繪制生存曲線，用Log-rank χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Dab1蛋白在乳腺組織中的表達

Dab1蛋白陽性表達的棕黃色顆粒主要定位于細胞核中；Dab1蛋白在乳腺癌癌旁組織中的陽性表達率84.0%（42/50）高于其在相應的乳腺癌組織的陽性表達率 48.0%（24/50）（χ2=100.00，P =0.000）。見圖1。

2.2 乳腺癌組織中Dab1蛋白表達與臨床病理特征的關系

Dab1蛋白在乳腺癌組織的陽性表達率隨著腫瘤分化程度的降低和腫瘤TNM分期的增高而增高（P＜0.05），無淋巴結轉移者高于有淋巴結轉移者（P＜0.05）；而與患者的年齡、是否絕經、腫瘤的病理類型及腫瘤大小無關（P＞0.05）。見附表。

2.3 乳腺癌組織中Dab1蛋白表達與患者生存的關系

在Oncomine數據庫中檢索乳腺癌中Dab1的表達情況，結果發現：明顯下調（P＜0.05，見圖2A），進一步證實本研究結果。另外，下載GEO數據庫中乳腺癌基因表達數據，并進行Kaplan-Meier法分析，結果顯示：Dab1高表達的乳腺癌患者比低表達的患者生存時間長，提示Dab1可作為判斷乳腺癌預后的分子指標（見圖2B）。

圖1 Dab1在乳腺癌組織及癌旁組織中的表達

圖2 乳腺癌組織中Dab1蛋白表達與患者生存的關系

附表 臨床病理特征與Dab1蛋白表達的關系

3 討論

我國乳腺癌的發病率呈逐年上升的趨勢，嚴重危害著女性的健康。乳腺癌的發生、發展是一個涉及多基因、多途徑的復雜過程，相關分子標志物的相繼出現雖然在一定程度上為乳腺癌的精準治療提供靶點，但由于腫瘤的異質性，仍需進一步去探究在乳腺癌的發生、發展中起關鍵作用的相關分子。Dab1基因是近年發現的一種基因，其在發育腦組織中高表達[7]，可介導Reelin信號參與調控細胞骨架，進而影響神經元的遷移和定位[8]。還有文獻報道[9]：該基因位于1個大的基因組不穩定區域，即普通型脆性位點（common fragile sites，CFS），該區域的基因易發生缺失。因此，許多CFS基因，如PARK2、FHIT及WWOX等，在腫瘤中呈抑制的狀態，其中WWOX和FHIT已被證實為抑癌基因，其表達水平的下調與腫瘤患者不良預后呈正相關[10-12]。因此，定位于該區域的Dab1基因是否也有抑癌基因的作用值得深入探究。已有研究表明該蛋白在子宮內膜癌和腦膠質瘤中表達異常，但其在乳腺癌組織中表達情況及其對乳腺癌發生發展的作用并不清楚。

本研究結果發現，Dab1蛋白在乳腺癌組織中表達降低，其在乳腺癌組織的陽性表達率低于其在癌旁組織的表達（P＜0.05）；同時，腫瘤數據庫結果提示，與癌旁組織比較，Dab1 mRNA的表達水平在乳腺癌組織中是降低的，這也從側面提示Dab1表達的減低可能與乳腺癌的發生與發展有關。為進一步了解Dab1在哪些類型的乳腺癌中低表達，筆者分析該蛋白在乳腺癌組織中的表達與其臨床病理特征的關系，結果發現，隨著腫瘤分化程度的降低，Dab1蛋白表達隨之減少，隨著腫瘤TNM分期越晚，Dab1蛋白表達就越低，在有淋巴結轉移的乳腺癌組織中Dab1的陽性表達率低于其在癌旁組織中的表達，而Dab1的經典作用為介導Reelin信號，調控細胞骨架而影響神經元的遷移和定位，眾所周知，眾多異常表達的細胞骨架調控分子，如EZRIN[13]、IQGAP1[14]在腫瘤轉移中發揮關鍵作用，故在有淋巴結轉移的乳腺癌組織中Dab1的陽性率降低更多可能與Dab1參與細胞遷移，從而負調節腫瘤細胞的遷移有關。此外，Dab1蛋白表達與乳腺癌患者的年齡、是否絕經、腫瘤的病理類型及大小無關。由此可見，腫瘤的分化程度越低，TNM分期越晚、惡性程度越高的乳腺癌，Dab1的表達越低，故推測乳腺癌的發病中該基因的低表達可能發生在疾病的晚期階段。曹讓娟等[5]的研究表明，Dab1對正常細胞周期發揮調控作用，故認為其可能是1個潛在的抑癌組織，有望成為乳腺癌治療的1個新靶點。而且Kaplan-Meier生存分析提示，Dab1高表達的患者總生存率高于低表達者（P=0.044），說明Dab1的表達與乳腺癌患者的預后有關，提示其可能成為乳腺癌患者預后評估的生物學指標。

綜上所述，Dab1在乳腺癌組織中低表達，與患者的腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結轉移及預后有關。因此，Dab1有可能成為乳腺癌惡性程度判斷、預后評估和治療的有效生物標志物，但是由于臨床研究樣本數太少，還需要大量臨床研究進一步驗證。

[1]REBECCA L S, KIMBERLY D M, AHMEDIN J, et al. Cancer statistics, 2015[J]. CA Cancer J Clin, 2015, 65(1): 5-29.

[2]易琳, 劉興明, 林丁, 等. 血清CA153,CA125,CEA聯合檢測在乳腺癌診斷中的價值[J]. 重慶醫科大學學報, 2012, 37(9): 802-805.

[3]TISSIR F, GOFFINET A M. Reelin and brain development[J]. Nat Rev Neurosci, 2003, 4(6): 496-505.

[4]MCAVOY S, ZHU Y, PEREZ D S, et al. Disabled-1 is a large common fragile site gene, inactivated in multiple cancers[J]. Genes Chromosomes Cancer 2008, 47(2): 165-174.

[5]曹讓娟, 李凱, 邢琬瑩, 等. Disabed-1在人乳腺癌細胞中的表達及其對細胞周期的影響[J]. 吉林大學學報(醫學版), 2016,42(5): 932-936.

[6]許良中. 免疫組織化學反應結果判斷標準[J]. 中國癌癥雜志,1996, 6(4): 230-231.

[7]TROTTER J, LEE G H, KAZDOBA T M, et al. Dab1 is required for synaptic plasticity and associative learning[J]. Neurosci, 2013,33(39): 15652-15668.

[8]CHAI X, FORSTER E, ZHAO S, et al. Reelin stabilizes the actin cytoskeleton of neuronal processes by inducing n-cofilin phosphorylation at serine[J]. Neurosci, 2009, 29(1): 288-299.

[9]MCAVOY S, ZHU Y, PEREZ D S, et al. Disabled-1 is a large common fragile site gene, inactivated in multiple cancers[J]. Gene Chromosome Cancer, 2008, 47(2): 165-174.

[10]GARDENSWARTZ A, AQEILAN R I. WW domain-containing oxidoreductase’s role in myriad cancers: clinical significance and future implications[J]. Exp Biol Med (Maywood), 2014, 239: 253-263.

[11]GAO G, KASPERBAUER J L, TOMBERS N M, et al. A selected group of large common fragile site genes have decreased expression in oropharyngeal squamous cell carcinomas[J]. Genes Chromosome Cancer, 2014, 53(5): 392-401.

[12]GAO G, SMITH D I, WWOX, large common fragile site genes,and cancer[J]. Exp Biol Med (Maywood), 2015, 240(3): 285-295.

[13]劉洋, 王軍, 李愛東, 等. Ezrin蛋白的生物學作用及其與腫瘤轉移的關系[J]. 現代生物醫學進展, 2015, 15(13): 2551-2580.

[14]王夏煒, 曹永倩, 張芮. 支架蛋白IQGAP1與腫瘤研究現狀[J].中華腫瘤防治雜志, 2014, 21(20): 1657-1661.