FOXO3a與乳腺浸潤性導管癌血管生成的相關性

常艷華，梁加貝，周志毅，蔡穎

（南京醫科大學附屬無錫市人民醫院 病理科，江蘇 無錫 214023）

乳腺癌是威脅女性健康的常見惡性腫瘤，其發病率在全世界呈上升趨勢。臨床上治療乳腺癌的常見方法是手術切除和輔助化療，由于乳腺癌容易轉移和復發，給治療帶來了巨大挑戰。腫瘤的復發和轉移是由多種復雜因素造成的，其中，腫瘤組織中新生血管數量的增加，為腫瘤組織的生長提供了必需的營養物質，使腫瘤得以快速生長，導致腫瘤易復發、易轉移的重要因素之一。

FOXO3a是FOX蛋白家族的重要成員，在哺乳動物的多種器官的細胞中均有表達。有研究表明[1]，FOXO3a轉錄因子可抑制血管內皮細胞的遷移及新生血管的形成。由此提出假設，FOXO3a可能抑制乳腺癌組織中新生血管形成，進而抑制腫瘤的生長。本研究通過檢測乳腺癌組織中FOXO3a的表達，分析其亞細胞定位與腫瘤內微血管密度的關系，探討其在乳腺癌新生血管形成中可能存在的作用和意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2014年1月-2014年12月南京醫科大學附屬無錫市人民醫院乳腺浸潤性導管癌患者的癌組織（乳腺癌組）及相應癌旁＞2 cm的組織（癌旁組）各102例。所有病例經病理證實，且術前均未接受過放療、化療及生物學治療。

1.2 試劑

FOXO3a兔抗人單克隆抗體購自Cell Signaling Technology（CST，#12829，稀釋度 1 ：100），CD34 鼠抗人單克隆抗體購自福州邁新公司（MAB-0034），EnVision試劑盒和DAB顯色劑購自福州邁新公司。

1.3 方法

石蠟包埋組織，4 μm厚切片，分別行HE染色和免疫組織化學（簡稱免疫組化）染色（采用EnVision兩步法）。實驗均設陽性對照和陰性對照。FOXO3a陽性定位于細胞核/質；CD34定位于血管內皮細胞的細胞膜/質，將CD34陽性的內皮細胞形成的管狀、窄裂隙狀、囊狀和空泡狀的結構，判定為可計數的微血管。微血管密度（microvessel density，MVD）計數采WEIDNER[2]的方法，先于低倍（100倍）光鏡下確定至少5個脈管著色最密集的區域，然后在高倍（400倍）光鏡下計數目標區域的微血管數，取計數最高的3個視野的均值作為該標本的MVD。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS18.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示；比較用t檢驗，計數資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FOXO3a在乳腺癌組及癌旁組的表達

FOXO3a在乳腺癌組表達的總陽性率為70.59%（72/102），72例陽性病例中有7例僅細胞核陽性，56例僅細胞質陽性，9例細胞核與細胞質均陽性；癌旁組表達的總陽性率為84.31%（86/102），86例陽性病例中有71例僅細胞核陽性，3例僅細胞質陽性，12例細胞核與細胞質均陽性；乳腺癌組FOXO3a總陽性率低于癌旁組（χ2=5.501，P=0.019）；乳腺癌組及癌旁組FOXO3a在細胞核表達的陽性率分別為15.69%（16/102）和81.37%（83/102），在細胞質表達的陽性率分別為63.73%（65/102）和14.71%（15/102）；兩組比較差異有統計學意義（χ2胞核=88.096，P=0.000；見圖1 和附表。

2.2 兩組MVD值及其與FOXO3a在乳腺癌組織中亞細胞定位的關系

兩組MVD的水平分別為（27.46±5.87）和（17.25±3.61），差異有統計學意義（t=22.224，P=0.000）。見圖2。乳腺癌組織中胞核FOXO3a陽性者MVD的水平（23.19±4.00）低于胞核FOXO3a陰性者（28.24±5.84）（t=3.314，P=0.001）；而胞質FOXO3a陽性者MVD的水平（26.39±3.12）與FOXO3a陰性者（27.90±4.37）比較，差異無統計學意義（t=0.827，P=0.795）。

圖1 兩組FOXO3a的表達 （免疫組化）

附表 兩組FOXO3a的表達比較 [n =102，例（%）]

圖2 兩組CD34的表達 （免疫組化）

3 討論

Forkhead轉錄因子是2000年被正式命名的新轉錄因子家族，該家族龐大，有17個亞家族，其中對FOXO亞家族的研究最為深入。目前在哺乳動物中已發現的FOXO家族成員有4個，為FOXO1、FOXO3a、FOXO4和FOXO6，其在細胞增殖、分化及凋亡等方面起重要作用[3-5]。FOXO3a廣泛表達于人的胃、結腸、直腸、肝、肺、乳腺和前列腺等各種組織器官中，作為重要的轉錄因子參與多種生理病理過程，調控細胞增殖、凋亡、氧化應激及內環境的穩態等過程[6-8]。

FOXO3a是胰島素PI3K-Akt信號通路的重要作用底物。胰島素樣生長因子能誘導PI3K/Akt級聯反應，蛋白激酶B（protein kinase B, AKT）可使FOXO3a磷酸化，磷酸化后的FOXO3a與核DNA親和力下降，而與伴侶蛋白14-3-3的親和力增加，FOXO3a/14-3-3蛋白結合體從細胞核轉位至細胞質，并阻止復合物逆轉運至細胞核內，FOXO3a滯留于細胞質中，無法激活下游的靶因子，而失去活性[9-10]。多個研究表明PI3K/Akt/FOXO3a信號通路參與乳腺癌的發生[11-12]，進一步研究發現，FOXO3a的活性高低、亞細胞定位以及參與的細胞信號轉導通路均與腫瘤的發生發展密切相關。本研究發現，FOXO3a在乳腺癌組的表達低于癌旁組，且FOXO3a主要表達于乳腺癌細胞的細胞質中，提示癌細胞中的FOXO3a定位出現異常，癌細胞胞質中的FOXO3a處于去活化狀態，失去對細胞增殖、凋亡相關因子的轉錄調節作用[9-10]，FOXO3a的異常表達與乳腺癌的發生、進展有相關性。

對血管內皮細胞的基因譜分析顯示，FOXO3a是血管內皮細胞中重要的轉錄因子，FOXO3a的活性下降可促進血管過度生成[13]。有研究表明，FOXO3a過表達與非小細胞肺癌組織中的微血管密度呈負相關[14]；FOXO3a與乳腺癌組織中血管生成的關系在國內外文獻中尚未見報道。本研究中，癌旁組織的FOXO3a主要表達細胞核中，可以發揮其抑制血管內皮細胞增殖的正常功能，從而抑制新生血管的形成；而在乳腺癌組織，FOXO3a在細胞核表達陽性者的微血管密度值低于胞核陰性者，胞質陽性者癌組織微血管密度值與胞質陰性者比較無差異。提示癌細胞中FOXO3a定位異常（從胞核轉位于胞質），其正常活性受抑制，不能發揮其限制內皮細胞增殖和遷移的能力[13]，間接促進新生血管的過度生成。

腫瘤的生長依賴新生血管的形成，而血管的形成與血管內皮的增殖密切相關。本研究表明，處于活性狀態的FOXO3a可負性調節血管內皮細胞因子的增殖。因此，通過調控FOXO3a的活性，促進FOXO3a活化而發揮其抑制血管形成的作用，有望為腫瘤治療提供新的思路。

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