廣西產拳卷地錢DNA的SCoT-PCR引物篩選及反應體系優化Δ

謝鳳鳳，李鵬，黎理，朱華#，尚小紅，李平鳳（.廣西中醫藥大學科學實驗中心，南寧53000；.廣西作物遺傳改良生物技術重點開放實驗室，南寧 530007）

隨著現代遺傳分子標記技術的發展，其在種質遺傳多樣性評價與親緣關系分析、種質資源鑒定、指紋圖譜與分子連鎖圖譜構建、基因表達差異、分子標記輔助育種以及功能基因克隆等方面的應用[1]逐漸成為熱點。分子標記技術有數十種之多，隨著研究目的不同，需要選擇相適應的標記方法。基因間隔區2-限制性DNA片段長度多態性（IGS2-RFLP）、簡單重復序列（ISSR）與目標起始密碼子多態性（SCoT）標記是常見的3種分子標記技術。其中，SCoT分子標記作為一種新型的目的基因分子標記技術，其引物設計簡單、通用性好，其產物可使用瓊脂糖凝膠電泳檢測，操作更加簡便，且條帶多態性高、有豐富的遺傳信息[2]。近5年關于SCoT分子標記的文獻已逾300篇，主要是將其應用于遺傳多樣性及親緣關系分析[3]、反應體系優化[4]、指紋圖譜分析[5]等方面的報道，表明SCoT分子標記的手段日趨成熟，可廣泛應用于多種植物的種質資源鑒定、遺傳信息分析等研究。

廣西產拳卷地錢來源于地錢科地錢屬植物拳卷地錢（Marchantia convolutaGao et Chang），始載于《西藏苔蘚植物志》，是苔蘚植物中常用的中草藥之一[6]。其常用于外治燙傷骨折、體癬、瘡病不斂，內治黃疸性肝炎，獲得了較好的療效[7-8]。廣西壯族自治區地處熱帶及亞熱帶地區，且地形以山地為主、海拔較高，因此地錢屬（MarchantiaL.）植物品種資源在這一地區分布頗多。資源調查情況和生藥學鑒定結果顯示，廣西境內地錢屬植物主要有地錢（M.polymorpha）、拳卷地錢（M.convolutaGao et Chang）和粗裂地錢（M.paleacea）3種[9]，尤以拳卷地錢的資源最為豐富。目前關于拳卷地錢的分子遺傳學研究極少，為了更好地開發利用廣西這一特色優勢藥材資源，確保其基源的準確性，本課題組提取了拳卷地錢的DNA，以其為模板篩選SCoT-聚合酶鏈式反應（PCR）體系的引物，并優化反應體系條件，為拳卷地錢的品種鑒定及資源開發提供技術基礎。

1 材料

1.1 儀器

DYY-6C型核酸電泳儀（北京市六一儀器廠）；JS-1075型凝膠成像分析系統（上海培清科技有限公司）；ABI-2720型PCR儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；Lambda265型紫外分光光度計（美國珀金埃爾默儀器有限公司）；BP211D型電子分析天平（德國賽多利斯公司）；H1850R型臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；HH-S4型恒溫水浴箱（上海一恒科技有限公司）。

1.2 試劑與引物

十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）抽提液（北京雷根生物技術有限公司，批號：NE0012-500mL）；kb DNA Ladder（批號：M1400-100T）、GoldView核酸染色劑（批號：G8140）均購自北京索萊寶科技有限公司；EX Taq酶套裝（含Taq DNA聚合酶、Buffer、dNTP）及DL Marker 2000、GelRed試劑均購自寶生物工程（大連）有限公司。

引物參照文獻[10]中的36條SCoT引物序列（見表1），均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 36條SCoT引物序列Tab 1 Sequences of 36 SCoT primers

1.3 藥材

拳卷地錢幼嫩葉狀體于2017年5月22日采自廣西來賓金秀鎮六拉沖村，經廣西中醫藥大學藥用植物教研室韋松基教授鑒定為拳卷地錢（M.convolutaGao et Chang）原植物。將藥材洗凈后于-20℃保存，備用。

2 方法與結果

2.1 拳卷地錢藥材樣品DNA提取及濃度測定

采用文獻[11]中的改良CTAB法提取拳卷地錢藥材樣品的DNA。采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA純度，設定電壓為110 V、運行時間為30 min（以下凝膠電泳試驗均設置相同條件）；然后經GoldView核酸染色劑染色，在凝膠成像分析系統上成像。采用紫外分光光度法，于260、280 nm處分別測定吸光度（A），用吸光度比值（A260/A280）表示DNA濃度。

凝膠電泳結果顯示，樣品DNA條帶整齊，無RNA污染、無降解、無彌散熒光，加樣孔清晰，表明所提取的樣品DNA純度較高；紫外分光光度法測定結果顯示，樣品DNA的A260/A280值為2.053（在1.8～2.0范圍內），表明所提取的樣品DNA濃度較高[11]。將樣品DNA稀釋至適當濃度，以備后續試驗使用。

2.2 SCoT引物篩選

以樣品DNA為模板，參考文獻[12]的條件對36條SCoT引物進行PCR擴增反應，參照“2.1”項下方法對PCR產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳、染色、成像，結果見圖1。

由圖1可見，編號為4、6、7、12、20、23、24、25、31、33、34、35的12條引物所得產物條帶整齊、明亮，無彌散熒光；編號為2、5、8、9的4條引物所得產物的條帶清晰、整齊、數量多，無彌散熒光；其余20條引物所得產物條帶清晰度欠佳、不成條帶，有明顯的彌散熒光，表明產物降解明顯。本課題組選擇產物亮度最高的4號引物進行PCR擴增反應體系的優化試驗。

2.3 SCoT-PCR擴增體系優化

2.3.1 正交試驗 相關研究發現，DNA濃度、Mg2+濃度、dNTP濃度、引物濃度、Taq DNA聚合酶濃度（酶濃度以其活力單位U/mL表示）5個因素對SCoT-PCR反應體系有顯著影響[2]，因此本課題組對上述影響擴增反應的5個主要因素（分別以因素A、B、C、D、E表示）進行5因素4水平的正交設計，按L16（45）正交表篩選最佳擴增反應體系。以“2.1”項下獲得的樣品DNA為模板，采用“2.2”項下篩選的4號引物進行PCR反應，總反應體積為20μL。擴增條件：94℃預變性4 min；94℃變性30 s，50℃退火1 min，72℃延伸90 s，35個循環；72℃再延伸5

圖1 36條引物擴增電泳圖Fig 1 Amplification electrophoresis figure of 36 primers

min。參照“2.1”項下方法對PCR產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳、染色、成像。采用直觀分析法[13]對成像后的產物擴增條帶的清晰度、數目、亮度及背景干凈程度進行評分[評分范圍為1～16分，成像效果最好者（條帶數目多、亮度強、背景清晰、無拖帶雜帶）得16分，效果最差者得1分，其余按照成像效果依次排序評分]，并對評分結果進行統計分析。正交試驗因素與水平見表2，正交試驗設計和結果見表3，擴增產物的凝膠電泳圖見圖2。

表2 因素與水平Tab 2 Factors and levels

由圖2可知，不同因素和水平組合的擴增反應體系所得產物在條帶數、清晰度和亮度方面均有差異；由表3可知，1～16號試驗的擴增反應產物評分值分別為9、14、7、10、2、6、11、16、3、8、4、15、5、1、12、13。

2.3.2 正交試驗結果分析 根據表3中的R值可知，各因素對擴增反應影響程度排序為Mg2+濃度（B）＞Taq DNA聚合酶濃度（E）＞dNTP濃度（C）＞DNA濃度（A）＞引物濃度（D）。根據表3中評分結果平均值可知，當DNA濃度為30 μg/mL時，所得產物評分的平均值10.00為最高；當Mg2+濃度為2.00 mmol/L時，所得產物評分的平均值13.50為最高；當dNTP濃度為0.20 mmol/L時，所得產物評分的平均值10.75為最高；當引物濃度為0.40 μmol/L時，所得產物評分的平均值9.75為最高；當TaqDNA聚合酶濃度為0.50 U/mL時，所得產物評分的平均值11.25為最高。綜上，最優SCoT-PCR擴增反應體系確定為A1B4C2D2E1，即30.00 μg/mL DNA、2.00 mmol/L Mg2+、0.20 mmol/L dNTP、0.40 μmol/L引物、0.50 U/mL Taq DNA聚合酶（總反應體積20 μL）。

表3 正交試驗設計與結果Tab 3 Orthogonal design and result

圖2 SCoT-PCR擴增產物凝膠電泳圖Fig 2 Electrophoretic diagram of SCoT-PCR amplifi cation products

3 討論

IGS2-RFLP、ISSR、SCoT這3種分子標記技術均可用于親緣關系分析、基因表達差異、分子標記輔助育種等方面的研究，但三者的區別主要在于：IGS2-RFLP構建指紋圖譜優勢更為明顯，準確性和可重復性大大優于ISSR，但其多態性檢測效率略低于ISSR；而對育種材料進行遺傳多樣性分析時，SCoT和ISSR所得產物多態性高、信息量大，能均勻地覆蓋整個基因組，但SCoT由于本身可能是目的基因的一部分或與目的基因緊密連鎖，在育種時篩選可利用性狀的效用會高于ISSR[14]。

關于拳卷地錢的分子標記分析僅見于ISSR-PCR反應體系的研究[15]。本課題組以SCoT法對拳卷地錢DNA進行標記，并采用正交試驗對SCoT-PCR反應體系進行優化，對各影響因素進行綜合分析。不同因素同一水平試驗結果的平均值反映了影響因素各水平對反應體系的影響程度，平均值越高，表明采用該水平的反應體系效果越好；R值則反映了各影響因素對反應體系的影響程度，R值越大，表明該因素影響越明顯。本研究結果顯示，各因素對SCoT-PCR擴增反應的影響程度排序為Mg2+濃度＞Taq DNA聚合酶濃度＞dNTP濃度＞DNA濃度＞引物濃度；其中Mg2+濃度和Taq DNA聚合酶濃度結果的R值分別為8.75和7.00，在5個因素中排前2位，表明這2個因素對試驗結果的影響最為顯著，故試驗過程中應特別注意對這2個因素的設置。

綜上所述，本研究所優化的DNA的SCoT-PCR反應體系，可為廣西產拳卷地錢品種鑒定、遺傳多樣性評價及親緣關系分析提供技術支持，進而為該藥材的資源開發利用提供實驗基礎。

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