LC-MS/MS法同時測定葛根藥材中14種異黃酮類成分的含量Δ

吳文杰，劉良紅，黃鶯（1.湖南中醫藥大學藥學院，長沙410208；2.香港浸會大學化學院，香港；.湖南醫藥學院藥學院，湖南懷化 418000）

葛根和粉葛分別為豆科植物野葛[Pueraria lobata（Willd.）Ohwi]和甘葛藤（P.thomsoniiBenth.）的干燥根，在中醫用藥史上二者均作為葛根（P.radix）藥材使用，具有解肌退熱、透發麻疹、生津止渴、升陽止瀉的作用[1]。葛根和粉葛被收載于2015年版《中國藥典》（一部）[2]；國家衛生和計劃生育委員會發布的國衛辦食品函〔2014〕975號文件中，在原有的85種藥食同源產品名單（含葛根）的基礎上新增了15種藥食同源產品（含粉葛）[3]，這說明二者需區別對待，以保證葛根藥材安全、合理使用。已有藥理動物實驗表明，葛根藥材中的有效成分具有改善心肌代謝及血管微循環、擴張冠狀血管、緩解高血壓、預防心律失常、改善腦血管循環、發揮雌激素樣效果、保護肝腎、抗自由基、抗缺氧癥狀、抗腫瘤、調節機體免疫功能、解酒等作用[4]。而異黃酮類成分是發揮藥理活性的主要藥效物質[5]，因此可作為葛根藥材質量分析的指標性成分。

目前，葛根藥材質量分析的方法主要為高效液相色譜法（HPLC）[6-7]，但是考慮到葛根藥材中含有多種化學成分，基質干擾較大，會影響檢測的準確性；同時其含有的一些異黃酮類成分含量較低，以HPLC法測定會由于靈敏度不夠而不易被檢出。液相色譜-串聯質譜法（LCMS/MS）具有穩定性良好、不受雜質干擾、靈敏度高等優勢[8]。中藥定量分析中常用的串聯質譜是三重四級桿質譜（QqQ），其在多反應監測（MRM）模式下可得到準分子離子質量和二級碎片質荷比的信息，加之該方法操作方便，故常被用于中藥有效成分檢測和質量控制[9-10]。但仍鮮見在MRM模式下測定葛根藥材中異黃酮類成分的報道，也尚未見MRM模式結合主成分分析和聚類分析區分葛根藥材的報道。

基于此，本試驗采用LC-MS/MS法同時測定了葛根藥材中14種異黃酮類成分的含量，用于藥材的整體質量控制；同時，采用主成分分析和聚類分析法區分14批不同來源（產地或種類）的葛根藥材，旨在為評價葛根藥材質量提供依據。

1 材料

1.1 儀器

AB SCIEX 5500型質譜儀（美國Applied Biosystems公司）；1260型HPLC儀，包括柱溫箱、二元溶劑管理器、自動進樣器（美國Agilent公司）；AUW2200型十萬分之一電子分析天平（日本Shimadzu公司）；KQ3200型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司，功率：150 W，頻率：40 kHz）。

1.2 試劑

葛根素對照品（批號：3681-99-0）、葛根素-6″-O-木糖苷對照品（批號：114240-18-5）、葛根素芹菜糖苷對照品（批號：103654-50-8）、4′-O-甲基葛根素對照品（批號：92117-94-7）、大豆苷元對照品（批號：486-66-8）、大豆苷對照品（批號：552-66-9）、芒柄花黃素對照品（批號：485-72-3）、刺芒柄花苷對照品（批號：486-62-4）、染料木苷對照品（批號：529-59-9）、染料木素對照品（批號：446-72-0）、黃豆黃苷對照品（批號：40246-10-4）、黃豆黃素對照品（批號：40957-83-3）、鳶尾苷對照品（批號：611-40-5）、鳶尾黃素對照品（批號：548-77-6）均購于上海源葉生物科技有限公司（純度經HPLC法檢測均不低于98%）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

葛根藥材分別來自于我國不同地區，經昆明植物標本館劉恩德博士鑒定為豆科葛屬植物野葛[P.lobata（Willd.）Ohwi]或甘葛藤（粉葛）（P.thomsoniiBenth.）的根。葛根藥材來源見表1。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Extend C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脫（0～30 min，20%A～70%A；30～40 min，70%A）；流速：0.8 mL/min；柱溫：22 ℃；進樣量：5 μL。

表1 葛根藥材來源Tab 1 Sources of P.radix

2.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源；檢測方式：負離子檢測；掃描模式：MRM；噴射電壓：-4 500 V；離子源溫度：600 ℃；霧化氣：60 psi；輔助氣：60 psi；碰撞氣：7 psi；氣簾氣：30 psi。14種待測異黃酮類化學成分的液質法參數見表2。

表2 14種待測異黃酮類成分的液質法參數Tab 2 LC-MS parameters of 14 kinds of isoflavones

2.3 溶液的制備

2.3.1 混合對照品溶液 分別取葛根素、葛根素-6″-O-木糖苷、葛根素芹菜糖苷、4′-O-甲基葛根素、大豆苷元、大豆苷、芒柄花黃素、刺芒柄花苷、染料木苷、染料木素、黃豆黃苷、黃豆黃素、鳶尾花苷、鳶尾黃素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成相應質量濃度的單一對照品貯備液。分別量取上述單一對照品貯備液適量，逐級稀釋，得質量濃度分別均為10、20、50、100、200、500、800、1 000、2 000、5 000 ng/mL的系列混合對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液 取藥材樣品粉碎，過40目篩，于40℃干燥箱中烘干至質量恒定。烘干后取0.1 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入30%甲醇50 mL，稱定質量，超聲處理20 min，室溫條件下放冷，用30%甲醇補足減失的質量，搖勻，經0.45 μm濾膜濾過后，取續濾液并稀釋至一定質量濃度（在線性范圍內），即得。

2.4 專屬性試驗

取“2.3”項下系列混合對照品溶液、供試品溶液各5 μL，分別按“2.1”“2.2”項下條件進樣測定，各待測成分在樣品中的提取離子流圖見圖1。由圖1可知，各待測成分均未檢測到干擾成分，表明方法專屬性良好。

2.5 線性關系考察

吸取“2.3.1“項下各質量濃度的系列混合對照品溶液各5 μL，按“2.1”“2.2”項下條件進樣測定，記錄峰面積。以各待測成分質量濃度（x，ng/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸。回歸方程與線性范圍見表3（注：考慮到葛根素含量最高，故采用的質量濃度上限為5 000 ng/mL進行回歸分析，其余13種成分則采用1 000 ng/mL進行回歸分析）。

2.6 精密度試驗

取“2.3.1”項下混合對照品溶液（100 ng/mL）5 μL，按“2.1”“2.2”項下條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，14種待測成分峰面積的RSD均小于3.47%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性試驗

稱取藥材樣品（編號：PL-5）粉末0.1 g，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置12、24、36、48、60、72 h時按“2.1”“2.2”項下條件進樣測定，記錄峰面積。結果，14種待測成分峰面積的RSD均小于5.00%（n＝6），表明供試品溶液于室溫下放置72 h內較穩定。

2.8 重復性試驗

稱取藥材樣品（編號：PL-5）粉末0.1 g，共6份，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”“2.2”項下條件進樣測定，記錄峰面積。結果，14種待測成分含量的RSD均小于3.93%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

稱取藥材樣品（編號：PL-5）粉末0.1 g，共6份，分別精密加入一定量的混合對照品溶液，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”“2.2”項下條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果，14種待測成分的平均加樣回收率為95%～105%，RSD為0.80%～4.50%（n＝6）。

2.10 含量測定

分別取各批藥材樣品適量，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”“2.2”項下條件進樣測定，計算樣品含量，結果見表4。

2.11 主成分分析與聚類分析

采用SIMCA 13.0軟件對14批不同來源的葛根藥材進行主成分投影分析，把14個成分轉化為第一主成分和第二主成分兩個綜合性指標，詳見圖2。由圖2可知，兩個主成分的貢獻率分別為71.4%和15.9%。采用SIMCA 13.0軟件對14批不同來源的葛根藥材進行聚類分析，詳見圖3。由圖3可知，14批葛根藥材可聚為4類：PL-2為Ⅰ類；PL-3、PL-4為Ⅱ類；PL-5～PL-7為Ⅲ類；PL-1、PT-1～PT-7為Ⅳ類。

圖1 各待測成分的提取離子流圖Fig 1 Extraction ion chromatograms of components to be measured

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

本試驗分別考察了乙腈和甲醇作為流動相中的有機相，發現乙腈和甲醇作為有機相時具有相似的色譜分離效果及質譜響應強度，但是因乙腈比甲醇昂貴且毒性更大，故選擇甲醇作為流動相中的有機相。筆者又以甲醇-水進行梯度洗脫，比較了不同比例甲酸（0.1‰、0.5‰、1‰）和乙酸（0.1‰、0.2‰、0.5‰）對分離效果的影響，結果發現上述酸溶液對各待測異黃酮類成分的峰形、響應強度和分離效果并無明顯影響。為使操作方法簡便易行，故選擇甲醇-水作為流動相。

3.2 質譜條件的優化

由于異黃酮類成分中含有1個或多個酚羥基結構，該結構容易失去氫，因此選用負離子模式進行監測，分子離子峰（監測母離子）均為[M-H]-。筆者又通過改變碰撞能量選擇具有較高響應的碎片離子作為監測子離子，并使母離子和監測子離子的響應比接近1∶3，以使MRM模式效果較好。

3.3 異黃酮總含量分析

表3 回歸方程與線性范圍Tab 3 Regression equations and linear ranges

表4 藥材樣品含量測定結果（mg/g）Tab 4 Results of content determination of samples（mg/g）

圖2 主成分投影圖Fig 2 Principal component projection drawing

圖3 聚類分析樹狀圖Fig 3 Hierarchical cluster analysis diagram

由表4可知，葛根藥材中14種待測異黃酮類成分的總含量范圍為37.337～74.911 mg/g（PL-1～PL-7）、5.127～19.036 mg/g（PT-1～PT-7），表明野葛和粉葛中異黃酮類成分總含量存在明顯差異。在14批藥材中，產地為云南芒市（PL-2）和甘肅天水（PL-4）的野葛比其他產地野葛的異黃酮類總含量明顯更高，產地為云南峨山（PT-1）和云南大關（PT-2）的粉葛比其他產地粉葛的異黃酮類總含量明顯更高，這說明不同產地的葛根藥材質量可能存在明顯差異。同時，葛根素在14種異黃酮類成分中含量最高，在云南芒市（PL-2）和甘肅天水（PL-4）產野葛中其含量分別為43.735、40.998 mg/g，比其他產地野葛中的葛根素含量明顯更高；在云南峨山（PT-1）和云南大關（PT-2）產粉葛中其含量分別為9.816、12.079 mg/g，比其他產地粉葛中的葛根素含量明顯更高，提示葛根素可以作為反映葛根藥材質量的重要指標。

綜上所述，本研究所建立的LC-MS/MS法操作簡單、重復性良好，可用于檢測葛根藥材中14種異黃酮類成分的含量，適用于該藥材的整體質量控制。

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[3] 國家衛生計生委辦公廳.國家衛生計生委辦公廳關于征求《按照傳統既是食品又是中藥材物質目錄管理辦法》（征求意見稿）意見的函(國衛辦食品函〔2014〕975號)[EB/OL].（2014-10-28）[2016-02-02].http：//www.cnfood.com/news/33/160479.html.

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