苗藥赤脛散提取物的體外抑菌活性研究Δ

劉蘭，黃家宇，陳俊，母艷華，周賢霞，潘柳岑，郭雨柔，李莉（貴州醫科大學藥學院，貴陽550025）

赤脛散（Polygonum runcinatum）為蓼科蓼屬植物，廣泛分布于貴州、四川、湖南等多個省份，為民間常用藥；其以根及全草入藥，性寒，味苦、澀，具有清熱解毒、活血止血等功效，主治急性胃腸炎、月經不調和跌打損傷等[1]。目前對赤脛散的研究報道主要集中在質量研究方面[2-4]，雖也有文獻報道其具有體外菌活性[5-6]，但缺乏系統研究。為了進一步明確赤脛散的體外抑菌作用，本研究根據赤脛散的民間用法并參考文獻5]選擇水和95%乙醇為提取溶劑，篩選得體外抑菌效果更好的95%乙醇提取物作為試驗對象；同時，考察95%乙醇提取物的乙酸乙酯及正丁醇萃取部位的抑菌活性，進一步明確赤脛散的抑菌活性部位。本文旨在為赤脛散的抑菌活性研究和藥材資源的開發利用提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

SW-CJ-1FD型凈化工作臺（廣州瑞智科學儀器公司）；AUY120型電子天平（日本島津公司）；GH-500隔水式培養箱（北京市永光明醫療儀器廠）。

1.2 藥品、試劑與培養基

氯霉素原料藥（上海源葉生物科技有限公司，批號：Y27N6C6020，純度：98%）；氟康唑原料藥（北京索萊寶科技有限公司，批號：1127A031，純度：98%）；95%乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、二甲基亞砜（DMSO）等均為分析純，水為蒸餾水。

水解酪蛋白（M-H）瓊脂培養基（批號：20160817）、M-H肉湯培養基（批號：20160817）均購自北京索萊寶科技有限公司；沙氏瓊脂培養基（青島尼賽欣合生物技術有限公司，批號：20151025）；無菌生理鹽水（貴州科倫藥業有限公司，批號：D17033101）。

1.3 藥材

赤脛散于2015年7月采收自貴州省息烽縣（批號：20150701），經由貴州醫科大學生藥學教研室龍慶德教授鑒定為蓼科蓼屬植物（P.runcinatumBuch.-Ham.Var.Sinene Hemsl.）。藥材自然晾干后粉碎為粗粉，室溫儲存備用。

1.4 標準菌株

傷寒桿菌（CMCC 50037）、金黃色葡萄球菌（ATCC 292131）、大腸埃希菌（ATCC 25922）、福氏志賀氏菌（CMCC 52337）、枯草芽孢桿菌（ATCC 9372）、綠膿桿菌（ATCC 27853）、乙型溶血性鏈球菌（ATCC 19615）、白色念珠菌（ATCC 10231）、新生隱球菌（D 247）均由貴州醫科大學感染與免疫學實驗室提供。

2 方法與結果

2.1 菌種的活化及菌懸液的制備

按無菌操作法[7-10]，將各標準菌株接種在相應的瓊脂培養基上復蘇（細菌用M-H瓊脂培養基在37℃條件下培養18～24 h；真菌用沙氏瓊脂培養基在37℃條件下培養24～48 h），轉接1次；用滅菌生理鹽水調整菌懸液濃度至0.5麥氏濁度單位，此時菌懸液菌濃度約為1.5×108CFU/mL；再取少量菌懸液，用滅菌生理鹽水稀釋至1.5×106CFU/mL，備用。

2.2 赤脛散提取物及不同極性部位萃取物的體外抑菌作用考察

2.2.1 藥液的制備 （1）水提物藥液：取赤脛散粗粉50 g，以10倍量水充分浸泡過夜后，煎煮3次，每次3 h；減壓抽濾，合并3次濾液，水浴蒸干，得水提物14.85 g。將水提物以無菌生理鹽水溶解，制成質量濃度為100 mg/mL的藥液（按生藥計算相當于337 mg/mL），備用。（2）95%乙醇提取物藥液：取赤脛散粗粉50 g，以10倍量95%乙醇回流提取3次，每次3 h；減壓抽濾，合并3次濾液，旋蒸減壓回收乙醇，水浴蒸干，得95%乙醇提取物19.24 g。將該提取物用含10%DMSO的無菌生理鹽水溶解，制成質量濃度為100 mg/mL的藥液（按生藥計算相當于260 mg/mL），備用。（3）95%乙醇提取物不同極性萃取部位藥液：取赤脛散95%乙醇提取物適量，用水混懸后，先用乙酸乙酯萃取，剩余藥液用正丁醇萃取。旋蒸減壓回收不同極性溶劑，真空干燥，分別得乙酸乙酯、正丁醇萃取部位8.81、6.59 g。將不同極性萃取部位分別用含10%DMSO的無菌生理鹽水溶解，制備成質量濃度均為50 mg/mL的藥液（按生藥計算相當于284、379 mg/mL），備用。（4）對照藥液：將氯霉素和氟康唑用無菌生理鹽水溶解，制成質量濃度均為300 μg/mL的藥液，備用。試驗前所有藥液均用0.22 μm濾膜過濾除菌。

2.2.2 體外抑菌作用考察 采用管碟法[11-13]進行測定。按無菌操作法[7-10]，分別吸取“2.1”項下菌懸液（1.5×108CFU/mL）100 μL至相應培養基表面（細菌用M-H瓊脂培養基，真菌用沙氏瓊脂培養基），用無菌棉簽涂布均勻，室溫下放置2～3 min，等距分散放置滅菌牛津杯（外徑為8 mm，內徑為6 mm，高度為10 mm），靜置10～15 min使其固定，向每個牛津杯中加入“2.2.1”項下各藥液100 μL，室溫下放置2 h使藥液擴散。每個平板均設置3個藥液平行組、1個藥物對照組（細菌用氯霉素、真菌用氟康唑為對照）和1個溶劑對照組（含10%DMSO的無菌生理鹽水）。將各培養皿于37℃培養（細菌培養18～24 h，真菌培養24～48 h），然后取出觀察抑菌圈并測量直徑。每種菌株平行操作3次。結果判定標準：抑菌圈直徑＜10 mm為抗藥（可認為無抑菌活性），10 mm為輕度敏感，11～15 mm為中度敏感，16～20 mm為高度敏感；抑菌圈直徑越大，則表明待測藥物抑菌作用越強[9]。抑菌圈直徑測定結果見表1。

由表1可見，赤脛散水提物抑菌圈大多在10 mm臨界值或以下，表明其幾乎無抑菌活性；95%乙醇提取物對除乙型溶血性鏈球菌以外的6種細菌的抑菌圈均大于10 mm，表明其有抑菌活性，其中對福氏志賀氏菌的抑制作用最強，且對福氏志賀氏菌和傷寒桿菌的抑制作用與對照藥物氯霉素相當，但是對2種真菌抑制效果不佳；乙酸乙酯部位對7種細菌的抑菌圈均大于10 mm，表明其均有不同程度的抑菌作用，且對傷寒桿菌和枯草芽孢桿菌的抑制作用最強，但對真菌無抑制作用；正丁醇部位對傷寒桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌圈均大于10 mm，表明其對這2種細菌有抑菌作用，但對其他菌株抑制效果不佳。綜合比較，赤脛散不同提取物的抑菌作用強度排序為：乙酸乙酯部位＞95%乙醇提取物＞正丁醇部位＞水提物。本研究進一步就赤脛散95%乙醇提取物及其乙酸乙酯、正丁醇部位對6種細菌的最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）進行考察。

表1 赤脛散提取物的抑菌圈直徑測定結果（±s，n＝3，mm）Tab 1 Diameters results of antibacterial circle for the extract from P.runcinatum（±s，n＝3，mm）

表1 赤脛散提取物的抑菌圈直徑測定結果（±s，n＝3，mm）Tab 1 Diameters results of antibacterial circle for the extract from P.runcinatum（±s，n＝3，mm）

注：“/”為未進行試驗；“N”為無抑菌圈Note：“/”means not tested；“N”means no antibacterial circle

樣品水提物95%乙醇提取物乙酸乙酯部位正丁醇部位氯霉素氟康唑細菌真菌白色念珠菌/N傷寒桿菌10.00±1.41 14.33±1.18 15.87±0.88 12.37±1.59 14.17±1.13/枯草芽孢桿菌10.87±2.65 12.17±0.76 15.87±1.59 10.87±0.88 16.50±1.32/綠膿桿菌N 11.83±1.26 14.00±1.41 8.75±1.06 16.00±0.87/福氏志賀氏菌N 14.50±1.00 15.62±2.65 10.25±0.35 14.00±0.66/金黃色葡萄球菌N 11.25±1.98 12.00±0.35 8.75±2.47 16.75±0.90/大腸埃希菌10.50±0.35 11.83±1.42 11.37±0.18 8.37±1.94 12.67±0.52/乙型溶血性鏈球菌N 9.92±0.95 10.12±0.53 N 13.17±0.76/10.37±1.59 9.00±1.41/13.92±0.63新生隱球菌/9.67±1.26 10.25±0.00 N/14.55±0.64

2.3 赤脛散95%%乙醇提取物及其乙酸乙酯、正丁醇部位對6種細菌的MIC和MBC測定

2.3.1 MIC 采用微量肉湯稀釋法[9-13]進行測定。按無菌操作法[7]，取一次性無菌96孔板（每排12孔），各加入M-H肉湯培養基100 μL，再分別吸取赤脛散95%乙醇提取物及其乙酸乙酯、正丁醇部位藥液100 μL加入第1孔，混勻后吸取100 μL加入第2孔，如此連續倍比稀釋至第10孔，第10孔中吸取100 μL棄去，此10個孔作為試驗組；第11孔只加培養基和菌液，用以觀察培養基是否適合菌株生長，作為生長對照組；第12孔只加培養基，用以觀察培養基是否被污染，作為培養基對照組。吸取濃度為1.5×106CFU/mL的菌懸液100 μL，依次加入到上述1～11孔中，充分混勻，此時各孔菌濃度均為7.5×105CFU/mL；吸取M-H肉湯培養基100 μL加入到第12孔中，充分混勻。將96孔板加蓋置于37℃恒溫培養箱中培養18～24 h后，取出觀察菌株生長情況。在黑色背景光源下，若與生長對照孔中生長特性相同（如肉湯渾濁或孔底出現渾濁），則判斷為有菌生長[9-10]。以無菌生長試驗孔所對應的最低藥物質量濃度記為該藥物的MIC。每種菌株平行操作3次，結果詳見表2～表4。

表2 赤脛散95%%乙醇提取物對6種菌株的MIC測定結果（n＝3）Tab 2 MIC results of 95%%ethanol extract from P.runcinatum to 6 kinds of bacteria（n＝3）

表3 赤脛散95%%乙醇提取物的乙酸乙酯部位對6種菌株的MIC測定結果（n＝3）Tab 3 MIC results of ethyl acetate fraction of 95%%ethanol extract from P.runcinatum to 6 kinds of bacteria（n＝3）

表4 赤脛散95%%乙醇提取物的正丁醇部位對6種菌株的MIC測定結果（n＝3）Tab 4 MIC results of n-butyl alcohol fraction of 95%%ethanol extract from P.runcinatum to 6 kinds of bacteria（n＝3）

由表2、表3、表4可知，赤脛散95%乙醇提取物對傷寒桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌的MIC為12.5 mg/mL，對綠膿桿菌、福氏志賀氏菌的MIC均為6.25 mg/mL；其乙酸乙酯部位對傷寒桿菌、綠膿桿菌、福氏志賀氏菌的MIC均為3.13 mg/mL，對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌的MIC均為6.25 mg/mL；其正丁醇部位對傷寒桿菌、枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌、福氏志賀氏菌的MIC為6.25 mg/mL，對金黃色葡萄球菌的MIC為25 mg/mL，對大腸埃希菌的MIC為12.5 mg/mL。

2.3.2 MBC 采用瓊脂培養基平板法[10]進行測定。分別從“2.3.1”項下未見細菌生長的孔中吸取100 μL培養液，分別接種至M-H瓊脂培養基平皿中，用無菌棉簽均勻涂布，置于37℃恒溫培養箱中培養18～24 h。用活菌計數法檢查平板上菌落，以平均菌落數＜5個對應的最小稀釋度的提取物質量濃度記為MBC[9-10]。每種菌株平行操作3次，結果詳見表5。

表5 赤脛散95%%乙醇提取物及其乙酸乙酯、正丁醇部位的MBC測定結果（n＝3）Tab 5 MBC results of 95%%ethanol extract，its ethyl acetate and n-butanol fractions from P.runcinatum（n＝3）

由表5可知，赤脛散95%乙醇提取物對枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌的MBC為12.5 mg/mL，對其余4種細菌的MBC均為25 mg/mL；其乙酸乙酯部位對傷寒桿菌、枯草芽孢桿菌、福氏志賀氏菌的MBC為6.25 mg/mL，對其余3種細菌的MBC為12.5 mg/mL；其正丁醇部位對傷寒桿菌、綠膿桿菌、福氏志賀氏菌的MBC均為12.5 mg/mL，對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌的MBC均為25 mg/mL。

3 討論

本研究選擇氯霉素和氟康唑作為陽性對照藥物。其中，氯霉素為廣譜抗生素，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有良好的抑菌效果；氟康唑為抗真菌藥物，對真菌的抑制作用良好。試驗中所有藥物的質量濃度均由本課題組根據文獻[14-15]及前期預試驗結果設定。

體外抑菌作用測定結果顯示，赤脛散水提物幾乎未見抑菌作用；95%乙醇提取物對各菌株的抑菌作用顯著強于水提物，且對6種細菌的抑制效果優于對2種真菌及乙型溶血性鏈球菌，在6種細菌中又以對福氏志賀氏菌的抑制效果最強；95%乙醇提取物的乙酸乙酯及正丁醇部位均表現出良好抑菌效果，但對真菌均無抑制作用。以上結果提示，赤脛散95%乙醇提取物及其乙酸乙酯、正丁醇萃取部位為抑菌有效部位，均對細菌有較好的抑制效果，但對真菌抑制效果不佳。

進一步對6種細菌的MIC考察結果顯示，赤脛散95%乙醇提取物的乙酸乙酯部位抑菌作用最強，其次為正丁醇部位，95%乙醇提取物的抑菌效果最弱；MBC的測定結果進一步證明乙酸乙酯部位抑菌效果最強。以上結果提示，赤脛散95%乙醇提取物的乙酸乙酯部位可作為抑菌活性部位應用，從中尋找赤脛散的有效抑菌活性成分是今后研究的方向。

綜上所述，赤脛散95%乙醇提取物及其乙酸乙酯、正丁醇萃取部位具有明顯的體外抑菌作用，尤其以乙酸乙酯部位最優。該結論為赤脛散這一民間常用藥的開發利用提供了一定的實驗依據，但其中具有抑菌作用的具體有效活性成分及其抑菌機制仍有待進一步研究。

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