產硫化氫釀酒酵母菌株對黑比諾干紅葡萄酒品質的影響

田秀,許引虎,李惠琳,王玉華,王婧*,王媛,王凱麗

1(甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州， 7300700) 2(甘肅省葡萄與葡萄酒工程學重點實驗室，甘肅 蘭州，730070) 3(安琪酵母股份有限公司 ，湖北 宜昌，443003)

葡萄酒中的含硫化合物一般具有不良的風味，如硫化氫、硫醇、硫醚、硫醇酯、含硫雜醇油及雜環化合物等，這些揮發性硫化物通常會對葡萄酒的質量產生不良影響[1]。硫化氫(H2S)是影響葡萄酒風味的主要揮發性硫化物，化學性質活躍，通常會通過釀酒酵母的硫代謝產生，具有不愉快的臭雞蛋味、臭鼬味、大蒜味或洋蔥味，會對葡萄酒香氣產生不良影響[2]。在葡萄酒發酵過程中，H2S的濃度水平只有每升數十至數百微克，但其感官閾值低，刺激作用明顯并難以去除。當葡萄酒中的H2S含量達0.12～0.37 mg/L時，在品嘗時就能感覺到其不良的氣味，當H2S含量高于0.7 mg/L(以H2SO4計)時，則葡萄酒往往具有明顯的還原味[1]。在葡萄酒陳釀過程中，H2S可以與一系列的葡萄酒成分反應生成其他的硫化物，從而對葡萄酒品質產生更廣泛的影響。例如H2S 可以與乙醛或乙醇反應形成具有橡膠味的乙二硫醇，而這種低級硫醇因有毒,而有害健康,也會破壞酒的風味[3]。因此，釀酒酵母對葡萄酒風味的影響復雜：既可以產生具有花香、果香的高級醇、酯類等物質，也可以產生具有臭雞蛋、煮白菜等不良風味的硫化物。

在葡萄酒釀造過程中H2S的產生及影響的研究受到國內外廣泛關注[4-10]本研究利用高產，中產及低產H2S的3株釀酒酵母菌株，分別發酵生產黑比諾干紅葡萄酒，分析3株菌株對黑比諾干紅葡萄酒理化指標，H2S生成量，谷胱甘肽含量，香氣物質成分及感官品質的影響，旨在明確釀酒酵母菌種之間H2S產生量的差異對干紅葡萄酒感官品質的影響，并且評價低產H2S酵母菌在葡萄酒釀造方面的潛在應用價值。

1 材料與方法

1.1 葡萄原料

黑比諾葡萄：2015年9月采自甘肅武威莫高實業發展股份有限公司黃羊鎮釀酒葡萄種植基地，含糖量225.43 g/L、含酸量9.5 g/L(酒石酸計)。

1.2 菌種與培養基

低產H2S釀酒酵母菌株D01：由安琪酵母股份有限公司贈送；中產H2S釀酒酵母菌株Z01：由本實驗室篩自甘肅河西走廊葡萄酒產區；商業釀酒酵母菌株紅佳釀Vintage Red：購于意大利Enartis公司。

YPD培養基(均為質量分數)：葡萄糖2%、蛋白胨2%、酵母浸粉1%。

1.3 試劑和儀器

1.3.1 試劑

2-辛醇，色譜純，SIGMA-ALDRICH(上海)貿易有限公司；福林酚顯色劑，國藥集團化學試劑有限公司；葡萄糖，天津市科密歐化學試劑有限公司；氫氧化鈉，天津市科密歐化學試劑有限公司；碳酸鈉，天津市科密歐化學試劑有限公司；偏重亞硫酸鈉，天津市科密歐化學試劑有限公司。均為分析純。

1.3.2 儀器

CP214型電子天平，上海奧豪斯儀器有限公司；GZX-GF101-Ⅱ電熱恒溫鼓風干燥器，北京科偉永興儀器有限公司；Genesis 10s紫外-可見分光光度計，美國Thermo Scientific公司；法國Dujardin Salleron公司；18100摩爾超純水機，上海摩勒科學儀器有限公司；TG-WAX氣相色譜柱，美國Thermo Scientific公司；TRACE1310-ISQ 氣相色譜質譜儀，美國Thermo Scientific公司。

1.4 方法

1.4.1 葡萄汁酒精發酵[11]

黑比諾葡萄經除梗破碎后裝罐，同時加入40 mg/L SO2，1 h后加入20 mg/L果膠酶在5 ℃條件下浸漬48 h后添加濃度為106CFU/mL供試釀酒酵母，并按10%的接種量接入葡萄汁啟動酒精發酵，發酵溫度控制在25～27 ℃，當含糖質量濃度低于4 g/L時，進行皮渣分離，葡萄酒轉入干凈的玻璃罐中，補加40 mg/L SO2，密封貯藏，期間進行2次澄清倒灌，每處理重復3次。

1.4.2 取樣點選擇[11]

發酵前取樣：將新鮮的黑比諾葡萄除梗破碎后靜置30 min，取50 mL葡萄汁樣品測定所需指標；酒精發酵前期取樣：葡萄汁經添加酵母后，取前期發酵液(殘糖量170 g/L左右)50 mL樣品測定所需指標；酒精發酵中期取樣：當發酵醪殘糖量為100 g/L左右時取50 mL樣品測定所需指標；酒精發酵末期：當殘糖量在50 g/L左右時取50 mL樣品測定所需指標；基酒取樣：發酵結束后，取樣50 mL測定所需指標。

1.4.3 H2S含量測定[1]

1.4.3.1 標準溶液

0.1%對氨基二甲基苯胺鹽酸鹽溶液：稱取對氨基二甲基苯胺鹽酸鹽0.25 g溶于250 mL 1∶1.5的HCl溶液中。

0.006 mol/L FeCl3的配制：0.324 FeCl3·6H2O溶于1∶10的HCl中并定容至200 mL。

Na2S標準溶液配制：稱取0.375 Na2S·9H2O溶于0.1 mol/L的NaOH溶液中，定容至100 mL，此溶液含H2S 0.500 g/L。

A溶液：取1 mL上述H2S溶液用0.1 mol/L NaOH定容至50 mL，此溶液含10.0 mg/L H2S。

B溶液：取1 mL A溶液用0.1 mol/L NaOH定容至50 mL，此溶液含200 μg H2S。

1.4.3.2 標準曲線的制備

取10 mL比色管，每管依次加入0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 200 μg/L的Na2S·9H2O溶液，分別補水稀釋到5 mL，加入0.1%對氨基二甲基苯胺鹽酸鹽溶液1 mL，搖勻，再加入0.006 mol/L FeCl3·6H2O 1 mL，蓋上塞子，搖勻，放置于暗處反應10 min，用10 mL以比色皿在670 nm下比色測吸光度，以水加試劑作空白參比，繪制標準曲線。回歸方程y=0.000 7x+0.001 7，相關系數R2=0.999 8，說明H2S的含量與吸光度值之間有良好的線性關系。

1.4.3.3 基酒中H2S含量的測定[1]

取澄清的酒樣5 mL，加到10 mL比色管中，加入0.1%對氨基二甲基苯胺鹽酸鹽溶液1 mL，搖勻，再加入0.006 mol/L FeC13·6H2O 1 mL，蓋上塞子，搖勻，放置于暗處反應10 min,，以試劑空白作參比，用10 mL比色皿在670 nm下比色，測出吸光度A1。

取5 mL澄清酒樣，加入2 mL 1∶4 HCl，混勻，以蒸餾水5 mL+2 mL 1∶4 HCl為對照，在670 nm下測出吸光度A2。

以(A1-A2)對照標準曲線計算S2-的含量。

1.4.4 GSH含量測定[1]

1.4.4.1 標準溶液

銅(II)-新銅試劑:稱取0.063 g CuSO4·5H2O，以20～30 mL水溶解，再稱取0.136 g的新銅試劑用8 mL無水乙醇溶解，二者充分混合后以水定容至250 mL，作為顯色劑。

GSH標準溶液：準確稱取0.01 g GSH以水溶解定容至100 mL，得到100 mg/L的標準溶液。

1.4.4.2 標準曲線的制備

取10 mL比色管，每管依次加入0、 0.1、0.2、 0.5、1.0、1.5、2.0 mL 100 mg/L的GSH標準液分別補水稀釋到2 mL，加入1 mL銅(II)-新銅試劑，加水稀釋定容至10 mL，蓋上蓋子，搖勻，穩定15 min后，以試劑空白作參比，用10 mL比色皿在456 nm 處測定試液的吸光度，繪制濃度與吸光度標準曲線。回歸方程y=0.004 1x+0.007 1，相關系數R2=0.999 2，說明GSH的含量與吸光度值之間有良好的線性關系。

1.4.4.3 基酒中GSH含量的測定[1]

取澄清酒樣1 mL，加入10 mL比色管中，加入1 mL顯色劑，補水定容至10 mL，蓋上蓋子搖勻，穩定10 min后以試劑空白(1 mL顯色劑加水定容到10 mL)，用10 mL比色皿在456 nm處測得吸光度A1。

在10 mL比色管中，加入1 mL澄清的酒樣，加水稀釋至10 mL，搖勻，蓋上蓋子，穩定15 min后，以水作參比，用10 mL比色皿在456 nm處測得吸光度A2。

以(A1-A2)對照標準曲線計算GSH的含量,結果乘以稀釋倍數2。

1.4.5 常規理化指標分析

1.4.5.1 總糖:費林試劑滴定法，總酸均參(GB/15038—2006)測定。

1.4.5.2 揮發酸：蒸餾后滴定測定(參照GB/15038—2006)。

1.4.5.3 酒精度：采用酒精測定儀測定。

1.4.5.4 色度色調：參照李素岳的方法[12]。準確吸取酒樣1 mL，用蒸餾水定容至10 mL容量瓶中，取稀釋后的酒樣于1 cm光程比色皿中，分別在420，520和620 nm下測定吸光度值，3者之和即為該酒樣的色度值，前兩者吸光度值之比即為色調值。

1.4.5.5 單寧：參照NY/T 1600—2008將1 mL酒樣用蒸餾水定容至100 mL，然后吸取1 mL樣品溶液分別加入5 mL水、1 mL鎢酸鈉一鋁酸鈉混合溶液及3 mL質量分數為7.5%的Na2CO3溶液顯色。靜置2 h后，于765 nm波長處測定樣品的吸光度，再根據標準曲線方程計算出樣品中單寧含量(y=0.118 8x-0.000 7，R2=0.999 1)。

1.4.5.6 總酚:參照李靜等的方法[13]，略有修改。將1 mL酒樣用蒸餾水定容至100 mL，然后吸取1 mL樣品溶液分別加入5 mL水、1 mL福林酚顯色劑及3 mL質量分數為7.5%的Na2CO3溶液顯色。靜置2 h后，于765 nm波長處測定樣品的吸光度，再根據標準曲線方程計算出樣品中總多酚含量(y=0.102 4x-0.005 8，R2=0.999 3)。

1.4.5.7 總花色苷:參照翦祎等[14]的方法，略有修改。吸取0.5 mL葡萄酒，用pH 1.0的緩沖液定容至10 mL。室溫平衡100 min，以蒸餾水為空白，分別于波長521 nm和700 nm處測定吸光度。用同樣的方法測定樣品在pH 4.5緩沖溶液中的吸光度。按公式(1)計算：

(1)

式中：A=(Aλmax-A700 nm)pH1-(Aλmax-A700 nm)pH4.5；MW=493.2 g/mol(錦葵色素-3-葡萄糖苷)；DF=稀釋倍數；1，光程，cm；ε=28 000摩爾消光系數。

1.4.5.8 柔和指數[15]：按公式(2)計算

S=A-T-C

(2)

式中：S，酒樣柔和指數；A，乙醇體積分數，%；T，單寧含量，g/L；C，總酸含量，g/L。

1.4.6 香氣物質檢測

1.4.6.1 香氣物質提取

取8 mL酒樣于頂空瓶中。加入2.4 g NaCl及10 μL內標物2-辛醇(88.2 ppm)加入磁力攪拌轉子，密封并搖勻，將搖勻的樣品放于40 ℃磁力攪拌器中，平衡30 min，插入萃取頭于40 ℃恒溫水浴鍋中磁力攪拌吸附富集30 min。

1.4.6.2 GC/MS條件

參照馬騰臻等[ 16]方法并略作修改。TG-WAX色譜柱(60 m×0.25 mm，0.5 μm)；升溫程序：40 ℃保持5 min，以5 ℃/min升至230 ℃，保持10 min；載氣(He)流速1 m L/min；不分流進樣；進樣口溫度250 ℃；電子電離源；電子能量70 eV；傳輸線溫度度230 ℃；離子源溫度250 ℃；質量掃描范圍m/z50～450。

1.4.6.3 定性定量方法[17]

由GC-MS分析所得的樣品質譜圖經計算機在NIST、Wiley數據庫檢索比對及資料參考，進行定性分析。各成分的含量采用內標法進行半定量分析，按公式(3)計算，并利用公式(4)計算氣味活性值(odor activity value，OAV)：

(3)

(4)

1.4.7 感官評定

感官分析根據(González-Sanjosé,Ortega-Heras, and Pérez-Magario 2009)描述的方法略有調整[18-19]。使用7分結構化數值尺度來量化，1代表沒有感覺，7代表感覺非常強烈。選擇8名經過專業培訓并具有葡萄酒品鑒資格證的人員，從色澤、酸度、收斂性、圓潤度、香氣、澄清度、甜味等7個方面品評。

1.4.8 數據處理與分析

每個實驗組設3 個平行，采用 Excel 2007進行數據處理，SPSS 19.0對數據進行單因素方差分析，并利用Duncan’s 多重比較在置信區間 0.05 下對數據進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 釀酒酵母菌株發酵黑比諾干紅葡萄酒H2S產生量分析

按照1.4.3的方法，分別對3株供試菌株發酵過程中的H2S產生量進行測定，結果如圖1所示。

圖1 種酵母菌株對黑比諾干紅葡萄酒硫化氫含量的影響Fig.1 Effects of three yeast strains on the hydrogen sulfide content of Pinot Noir dry red wine注：同一取樣時間a、b、c表示樣品在0.05水平差異顯著，下同

3株供試菌株在酒精發酵過程中H2S的產生量出現顯著差異，酒精發酵過程中H2S產生量均呈現先增長后穩定的趨勢。可以看出，在酒精發酵過程中H2S主要在發酵前期生成，并呈現指數增長，在發酵中后期呈現緩慢增長，到酒精發酵結束，H2S產生量不再增加，并且H2S的產生與菌株關系密切。

2.2 酵母菌株對黑比諾干紅葡萄酒GSH含量的影響

按照1.4.4的方法，對3株酵母發酵結束后基酒中GSH生成量進行測定，結果如圖2所示。

圖2 三種酵母菌株對黑比諾干紅葡萄酒GSH含量的影響Fig.2 Effect of three yeast strains on GSH content of Pinot Noir dry red wine

谷胱甘肽(GSH)在細胞代謝過程中均起著抗氧化的作用，由圖2可以看出，3種菌株所得基酒中，GSH含量差異顯著， D01菌株發酵的基酒中GSH含量最高，為32.90 mg/L； Z01和Vintage Red菌株發酵的基酒中GSH含量分別為20.79 mg/L和11.29 mg/L，與D01酒樣相比分別降低了12.11 mg/L和21.61 mg/L，Vintage Red菌株發酵后GSH產生量顯著降低。這可能是由于在葡萄汁進行酒精發酵時，GSH能在一定條件下抑制了H2S的產生，GSH積累量越多 H2S 生成量就越少[20]。

2.3 常規指標分析

由表1可知，采用3株釀酒酵母菌株發酵的酒樣中，酒精體積分數、還原糖含量、揮發酸含量均符合國標GB15037—2006對干紅葡萄酒的規定，說明3株釀酒酵母菌株都具有良好的酒精發酵能力。

表1 酒樣的理化指標測定Table 1 Three kinds of alcohol samples of physicaland chemical indicators

葡萄酒的色度是評價葡萄酒外觀一個重要指標，色度值越高，表明葡萄酒的顏色越深；色調值反應葡萄酒黃色與紅色的比值，色調值較低的酒體其紫紅或寶石紅色調明顯[21]。由表1 可知，3種酒樣中色度值差異顯著，最低的是D01發酵的酒樣(0.49)，最高的為Vintage Red發酵的酒樣(0.65)，Z01 和Vintage Red色調值分別為0.93和0.99，差異不顯著，但低于D01菌株的酒樣(1.18)，這可能是由于3種釀酒酵母菌株細胞壁對葡萄酒色素吸附作用的不一致導致。ESCOT等人也曾報道了釀酒酵母菌株之間其細胞壁對葡萄酒色素吸附性差異較大[22]。

葡萄酒中含有大量的酚類物質，其含量和比例都將影響葡萄酒的感官品質，尤其是對紅葡萄酒的色澤、苦味、收斂性、澄清度和穩定性等具有重要作用[23]。對于總酚和單寧的含量來說，D01發酵的酒樣中，單寧含量為1.10 g/L，與其他兩個酒樣相比差異顯著，高出 0.15 g/L。

花色苷是紅葡萄酒中主要的呈色物質，是紅葡萄酒外觀品質和感官質量的重要決定因素之一，它賦予了葡萄酒新鮮或深沉的顏色[24]。此外，花色苷作為酚類物質對葡萄酒口感也起到很大作用。由表1可知3株供試菌株發酵酒樣中總花色苷含量也出現顯著差異，D01發酵的酒樣中，總花色苷含量為128.88 mg/L，較其他兩個酒樣相比分別提升了7.05 mg/L和20.85 mg/L，提高程度差異明顯。

柔和指數反應了葡萄酒的口感，收斂程度和平衡感，是評價葡萄酒協調性的關鍵參數。由表1可以看出，D01，Z01及Vintage Red菌株發酵的酒樣柔和指數分別為9.25、8.85和9.02，有研究表明，柔和指數達到5.0以上的葡萄酒品質較好[25]。說明H2S產生量的不同對酒樣柔和度影響不大。

2.4 黑比諾干紅葡萄酒樣的香氣物質分析

2.4.1 黑比諾干紅葡萄酒香氣構成

經過譜庫檢索對比，鑒定出的芳香化合物定性及半定量結果見表2。

表2 黑比諾干紅葡萄酒香氣成分及含量與香氣成分香氣活性值(OAV)及特征描述Table 2 Ingredients of Hygienic red wine aroma components and content and aroma componentsaroma activity value (OAV) and characterization

續表2

編號化合物名稱含量(μg/L)D01Z01Vintage Red閾值(μg/L)OAVD01Z01Vintage Red氣味描述醇類B1丙醇313.57±0.05—87.07±0.56\\B2異丁醇85.15±1.3184.40±0.54146.83±0.81\\B3正丁醇10.64±0.2515.87±3.2115.02±3.21150 000<1<1<1草藥、醇味B41-戊烯-3-醇2.56±0.502.66±0.522.69±0.20\\B5正戊醇1 906.17±2.612 564.94±3.382 912.06±2.151 0001.912.562.91辛辣的、青草香B63-甲基-1-戊醇5.74±0.548.42±1.6715.01±0.08\\B7正己醇654.54±2.69585.01±2.89548.47±1.545212.5911.2510.55草本植物、青草味B8葉醇14.46±2.6621.11±1.5311.74±0.66\\B93-乙氧基丙醇28.62±0.16—8.56±0.581000.290.09—輕微的果香B101-辛烯-3-醇4.84±0.46—5.90±0.46\\B11庚醇55.22±0.5830.41±3.2142.87±0.782500.220.120.17檸檬、柑桔B122-壬醇4.57±0.754.10±0.575.66±0.45\\B131-壬醇59.71±0.5947.84±0.8254.50±0.53\\B14異植物醇4.55±1.393.49±0.25—\\B151-癸醇51.87±0.43—39.61±2.455000.1—0.08橙花香B161-十一醇17.44±0.8411.49±0.3021.54±0.93\\B17苯乙醇861.81±0.75588.20±4.9942.49±0.321 1000.760.550.04玫瑰、花粉香B18月桂醇39.11±1.1630.42±2.59—\\B19反式-橙花叔醇6.83±1.973.41±0.125.64±0.03\\B20豆蔻醇16.27±0.287.63±0.23—\\B211-十五醇8.67±0.226.48±0.396.17±0.19\\B221-十六烷醇0.55±0.0315.31±0.53—\\B234-甲基-1-戊醇—2.59±0.216.27±0.21\\B24正辛醇—82.50±3.23ND8000.1——茉莉香、檸檬味B252-十六烷醇—7.25±0.111.43±0.02\\B26異戊醇——19.17±0.24\\B272,3-丁二醇——22.66±0.10120 000<1——黃油、乳酪B28(Z)-6-壬烯-1-醇——12.66±0.27\\B29順-4-癸烯-1-醇——12.61±0.11\\B30十二醇——34.88±1.11\\B31法呢醇—5.39±0.27ND\\B32棕櫚醇——11.57±0.04\\B331-十四醇——6.17±0.10400——0.02蠟香總量4 149.894 128.924 092.98酸類C1乙酸57.36±0.20244.28±0.5096.66±1.3320 000<1<1<1醋酸味C2丙酸11.19±1.75132.46±1.01—8 1000.02<1—脂肪、果香C3丁酸25.51±2.5214.66±0.5210.71±0.042 3000.01<1<1奶酪、酸敗油味C42-甲基己酸43.91±0.5040.08±0.5455.09±0.32\\C5月桂酸214.64±3.13184.65±3.43186.75±0.121 0000.210.180.19干果,金屬,月桂油C6二十碳五烯酸0.92±0.024.76±0.84—\\C7辛酸878.20±0.52105.20±2.72817.2±1.321 3540.650.080.6澀味、奶油味C8癸酸164.25±3.31117.25±0.7278.69±0.561 0000.160.120.08酸腐味,脂肪味C99-癸烯酸15.00±0.6110.49±0.918.24±0.041 0000.020.01<1脂肪味C103,7-二甲基-2,6-辛二烯酸2.61±0.06——\\C11反式-2-己烯酸—4.10±2.35—\\C12壬酸—4.97±0.476.15±0.47\\C13香葉酸—2.42±0.172.05±0.77\\C14異戊酸——55.09±0.46\\C15庚酸——7.25±0.47\\總量1 413.59865.321 323.88

續表2

編號化合物名稱含量(μg/L)D01Z01Vintage Red閾值(μg/L)OAVD01Z01Vintage Red氣味描述醛酮萜稀類D1癸醛—16.16±0.6520.65±0.2610—1.622.07生青味D2大馬士酮34.79±0.3428.03±2.3531.87±0.2065.84.675.31焦糖、椰子D3β-紫羅酮12.17±0.406.65±2.2910.57±0.20\\D42-十五烷酮12.00±0.7513.09±1.11—\\D52-壬銅17.60±1.13——1 2500.01——果香,花香,脂肪味D6月桂醛10.44±0.129.13±0.10—\\D7順-7-十四烯醛—7.34±0.22—\\D82-十五烷酮———\\D92,4-二甲基苯甲醛18.43±0.04——\\D10香葉基丙酮76.75±0.7368.42±0.28—\\D11正十五碳醛——10.73±0.72\\D12α-己基肉桂醛1.12±0.29——\\D13月桂烯1.35±0.282.37±0.071.03±0.02\\D14香茅醇27.87±0.94——400.7——檸檬、柑桔香D15橙花醇10.55±0.598.10±0.249.10±0.203000.040.030.03橙花、玫瑰、檸檬D16α-松油醇—2.24±0.273.49±0.03330—<10.01樟腦味、辛辣味D17芐醇—71.71±0.4875.57±1.22\\D18β-蒎烯—1.03±0.01—\\總量223.07234.27163.01其他類E1丁香酚4.33±0.17——2 176<1<1—山楂E24-乙烯基-2-甲氧基苯酚2.38±0.29——\\E32,4-二叔丁基苯酚—42.85±0.3352.53±0.77200—0.210.26石碳酸味E41,6-二仲丁基苯酚—7.22±0.22—\\E52,6-二叔丁基對甲酚38.25±0.9029.68±0.5936.25±0.19\\總量44.9679.7588.78

注：—，未檢測到香氣成分;，未查到相關資料。

由表2可知，3種酵母菌釀造的酒樣中共鑒定出105種香氣成分，主要包括酯類34種、醇類33種、酸類15種、羰基化合物(醛和酮)12種、萜烯類6種和酚類5種，分別占檢出組分的32.38%, 31.43%, 14.29%, 11.43%, 5.71%和4.76%。其中D01、Z01、Vintage Red酒樣中各定性檢測出63、72、65種成分，3者共有香氣成分為37種，占總組分的35.23%。

2.4.2 香氣成分比較分析

葡萄酒中揮發性香氣成分對葡萄酒感官特征有重要影響，主要由酯類、醇類、醛類、酮類等化合物組成[26]。各香氣成分對葡萄酒的實際香氣貢獻取決于其氣味活度值(質量濃度與閾值的比值，OAV)[27]。

2.4.2.1 酯類物質

葡萄酒中的酯類物質產生于酵母或細菌的代謝與葡萄酒陳釀過程中，主要包括乙醇酯、乙酸酯和其他酯類。大多數酯類可以賦予葡萄酒果香和花香氣味，增加酒體的香氣復雜性和典型性[28]。本試驗的3種酒樣中共檢測出34種酯類物質。低產H2S的D01菌株發酵的酒樣中酯類物質有20種，其總的質量濃度為3 846.0 μg/L，其中OAV值大于1的酯類有7種，這些酯類成分含量由大到小分別：癸酸乙酯、棕櫚酸乙酯、己酸乙酯、乙酸己酯、辛酸乙酯、庚酸乙酯，這些酯類物質均能夠給酒樣增加果香味[28]；中產H2S的Z01菌株處理的酒樣中檢測出酯類物質有25種，但其總的質量濃度為3 027.02 μg/L，顯著低于D01菌株發酵的酒樣，其 OAV值大于1的酯類有4種，主要為癸酸乙酯、棕櫚酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯；Vintage Red處理酒樣中酯類有17種，其總的質量濃度為2 702.71 μg/L，其中OAV值大于1的酯類有3種，主要為癸酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯。由此可以看出，3種菌株釀造的酒樣中酯類物質總質量濃度差異顯著，D01處理中雖然酯類物質種類沒有Z01處理的多，但其總質量濃度卻顯著高于其他兩種處理，并且在果香味方面的香氣貢獻也顯著高于其他兩個處理。

2.4.2.2 醇類物質

醇類物質是酵母代謝的次級產物之一，主要由發酵過程中糖代謝、氨基酸脫羧、脫氫產生，是酒中主要香氣物質[28]。本研究中，3種酒樣中共檢測出33種醇類物質，其中有14種成分3種酒樣中共有。D01菌株發酵的酒樣中醇類其總的質量濃度最高，為4 149.89 μg/L， Z01、Vintage Red發酵的酒樣中醇類含量差別不大，分別為4 128.92 μg/L、4 092.98 μg/L，這兩種酒樣中主要醇類成分為正戊醇和正己醇，賦予酒體青草味，而D01酒樣中主要醇類成分為正戊醇、正己醇和苯乙醇，其中苯乙醇由苯丙氨酸代謝產生，具有獨特的紫羅蘭香、丁香、茴香和玫瑰香味，能夠賦予葡萄酒復雜香氣[29-30]。

2.4.2.3 酸類物質

酸類物質大部分來源于酵母菌和乳酸菌代謝的副產物。在3種酒樣中檢測出15種酸類物質，其中8種酸類物質是3種酒共有的。D01 、Z01及Vintage Red菌株發酵的葡萄酒樣中酸含量分別達到1 413.59、865.32、1 323.88 μg/L。當酸類物質的含量低于閾值時，對酒的感官質量有積極的貢獻，可以使酒中的各種香氣物質更加的平衡，可是如果高于閾值就會對香氣帶來負面影響[31]。此外酸類物質還可以與醇類物質發生作用，生成相應的酯類物質，從而給酒體帶來愉快的香味。在本試驗中D01酒樣中酸類物質的含量高于其他兩種酵母菌所釀酒樣，且其含量與閾值相比基本上均處于低濃度水平。

2.4.2.4 醛酮、萜烯類及其他化合物

在3種酒樣中檢測到6種酮類、6種醛類，相對含量分別為1.01%～1.58%和0.30%～0.39；帖烯類6種，相對含量為0.41%～1.07%；5種揮發性酚類物質，相對含量為0.46%～1.06。盡管這些物質的含量較低，但對酒體依然具有一定的貢獻。如3種酒樣中都檢測到了具有焦糖和玫瑰香氣的β-紫羅酮和大馬士酮，但只有D01酒樣中檢測出了2-壬酮及丁香酚，2-壬酮具有果香、花香、脂肪味，是一種葡萄酒中特殊的物質，丁香酚具有山楂的香味，因為這些萜烯類物質的感官閾值一般都非常低，所以其OAV很高，他們對總體香氣形成的貢獻不可忽視[32-33]。

2.5 主成分分析

為了直觀地分析3種酵母菌株酒精發酵后對黑比諾干紅葡萄酒中呈香物質的差異，對檢測出各類呈香化合物的含量進行主成分分析，相關矩陣的特征值和貢獻率見表3。主成分1的方差貢獻率為54.62%， 主成分2的方差貢獻率為43.38%，二者累積貢獻率已經達到97.99%，基本上已經能反映樣品的風味品質信息，因此選取前2個主成分進行分析。

表3 主成分的特征值及貢獻率Table 3 Eigenvalues and contribution rates of principalcomponents

由圖3-a可知，D01 、Z01及Vintage Red菌株分別釀造的葡萄酒根據各香氣成分的得分明顯分為3個區域，且3個酒樣相距都比較遠。圖3-b為鑒定出的105種香氣化合物載荷圖，因子的載荷系數反映了酒樣中各揮發性香氣物質對各主成分的影響，相關系數越大，說明主成分對該變量的代表性越強。從圖3-b可以看出，辛酸乙酯、庚酸乙酯、2壬銅、己酸異戊酯、大馬士酮、反式-4-癸烯酸乙酯、2-甲基己酸與主成分1高度正相關，而丁香酚、月桂酸乙酯、異丁酸、葉醇、月桂烯、9-十六碳烯酸乙酯、2-十五烷酮、2,6-二叔丁基對甲酚、乙酸乙酯與主成分1高度負相關；十一酸乙酯、癸酸異丁酯、癸酸3-甲基丁酯、2,2,4-3甲基-1,3-戊二醇二異丁酸酯、肉豆蔻酸異丙酯、肉桂酸乙酯、1-十六烷醇、4-甲基-1-戊醇、正辛醇、2-十六烷醇、月桂醛、順-7-十四烯醛、芐醇與主成分2高度正相關，辛酸丙酯、3-羥基丁酸乙酯、癸酸乙酯、癸酸正丙酯、乙酸苯乙酯、肉豆蔻酸乙酯、丙醇、正己醇、1-辛烯-3-醇、反式-橙花叔醇、豆蔻醇、1-十五醇、辛酸、癸酸、9-癸烯酸、3,7-二甲基-2,6-辛二烯酸、β-紫羅酮、香茅醇、橙花醇與主成分2高度負相關。

結合圖6可知，D01酵母菌釀造的酒樣位于主成分1的右下側，正己醇、1-十五醇對其有顯著影響，香氣品質優于Vintage Red和Z01的酒樣。

2.6 感官分析

圖4 感官分析雷達圖Fig.4 Radar map of sensory analysis

對3株產H2S差異顯著的釀酒酵母菌株發酵所得的葡萄酒進行感官分析，比較酒樣在感官方面的不同。由圖4可知，6種感官指標中有3種差異明顯，D01葡萄酒的香氣、收斂性及圓潤度均高于其余兩種酒樣，但是在色澤方面低于其余兩種酒樣。而在酸度、甜味方面3種酒樣差異不大，通過感官評價，說明低產H2S釀酒酵母菌株D01發酵后的葡萄酒感官品質明顯優于中、高產H2S的葡萄酒。

3 結論

利用低產、中產、高產H2S的3株釀酒酵母菌株D01、Z01、Vintage Red，分別釀造黑比諾干紅葡萄酒，所得酒樣中H2S產生量差異明顯，對3種酒樣中GSH含量的測定結果表明，GSH生成量與H2S 生成量呈反比關系。采用HS-SPME和GC-MS聯用技術，通過定性和定量相結合的方法分析3種基酒的香氣成分， 低產H2S的D01菌株發酵的酒樣中對果香味貢獻較高的酯類物質主要為癸酸乙酯、棕櫚酸乙酯、己酸乙酯、乙酸己酯、辛酸乙酯、庚酸乙酯，中產H2S的Z01菌株發酵的酒樣中香氣貢獻值較大的酯類有4種，主要為癸酸乙酯、棕櫚酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯；中產H2S的Vintage Red酒樣中香氣貢獻較大的酯類物質分別為癸酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯。3種菌株發酵酒樣中主要醇類成分為正戊醇和正己醇，賦予酒體青草味。其次，3種酒樣中都檢測到了具有焦糖和玫瑰香氣的β-紫羅酮和大馬士酮，但只有D01酒樣中檢測出了具有果香、花香、脂肪味的2-壬酮和具有山楂香味的丁香酚。通過感官評價，低產H2S的D01菌株釀造的葡萄酒其香氣、收斂性及圓潤度均高于其余兩種酒樣，但是在色澤方面低于其余兩種酒樣。

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