水稻粉質胚乳fse3突變體的表型分析及基因定位

于艷芳，劉喜，田云錄，劉世家，陳亮明，朱建平，王云龍，江玲，張文偉，王益華，萬建民

（南京農業大學農學院/作物遺傳與種質創新國家重點實驗室/江蘇省植物基因工程技術研究中心，南京 210095）

0 引言

【研究意義】胚胎發生和胚乳發育對于種子形成是必不可少的，并且對水稻品質和產量至關重要。因此，研究這些過程的分子機制具有相當重要的意義。水稻胚乳在發育過程中積累大量的淀粉，約占籽粒干重的90%，其主要功能是為種子萌發及后期幼苗的生長發育提供營養物質，并作為人類重要的食物來源，為人類的生理活動提供主要的能量[1]。水稻胚乳中淀粉含量直接決定水稻的產量，同時其中的直鏈和支鏈淀粉的比例和結構影響著稻米的品質[2]。在籽粒的形成過程中，光合產物蔗糖在胚乳細胞中經造粉體內一系列的淀粉合成酶的催化加工形成可見的淀粉顆粒，同時整個胚乳細胞內造粉體和淀粉粒也在不斷增殖和發育。隨著籽粒的成熟，整個胚乳內充滿了排列整齊的淀粉顆粒[3]。貯藏淀粉的合成是一個非常復雜而精細的生物過程，但目前人們對這個過程的了解尚不充分。因此，克隆和鑒定水稻淀粉合成相關基因并對其功能進行研究，不僅對闡釋水稻淀粉合成的分子機理具有生物學意義，同時將為稻米品質改良提供理論指導。【前人研究進展】胚乳淀粉分為直鏈淀粉和支鏈淀粉兩類，直鏈淀粉是由1 000—5 000個葡萄糖單體經 α-1,4糖苷鍵連接而成的線性分子，而支鏈淀粉則是葡萄糖經 α-1,6糖苷鍵聚合而成的多分支分子。淀粉合成首先是植物葉片通過光合作用合成葡萄糖，隨后轉化為蔗糖，蔗糖再通過維管束被運輸到籽粒造粉體中，接著在尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UDP glucose pyrophosphorylase，UGPase1）的作用下水解為 UDP-葡萄糖和果糖，然后轉化為 1-磷酸葡萄糖，接著在腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADP glucose pyrophosphorylase，AGPase）的催化下合成腺苷二磷酸葡萄糖（ADP-glucose，ADPG），最后ADPG經過一系列酶促反應轉變為淀粉，這些酶包括淀粉合成酶（starch synthase，SS）、顆粒淀粉合成酶（granule-bound starch synthase，GBSS）淀粉分支酶（starch branching enzyme，SBE）和淀粉去分支酶（debranching enzyme，DBE）[4-6]。其中顆粒淀粉合成酶（GBSS）主要負責直鏈淀粉的合成[7-9]，淀粉合成酶（SS）、淀粉分支酶（SBE）[10-11]和淀粉去分支酶（DBE）則負責支鏈淀粉的合成。淀粉分支酶（SBE）的缺失會導致支鏈淀粉短鏈合成發生障礙，胚乳粉質，同時伴有籽粒變小，千粒重下降的表型[12]。此外，水稻淀粉的合成還會受到一些轉錄因子的調控。之前報道轉錄因子RSR1會負向調控淀粉合成基因的表達，rsr1突變體胚乳中的所有淀粉合成基因表達量均上調，直鏈淀粉含量增加，籽粒變大，粒重增加[13]。堿性亮氨酸拉鏈轉錄因子OsbZIP58可以直接調控OsAGPL3、OsSSIIa、SBE1、Wx、OsBEIIb和ISA2的表達，osbzip58突變體總淀粉和直鏈淀粉含量顯著下降，同時千粒重降低[14]。在對淀粉合成相關基因的研究中，人們通過尋找胚乳突變體來揭示更多的調控機制。水稻胚乳突變體表型主要分為六類：糯性（waxy）、粉質（floury）、皺縮（shrunken）、暗色（dull）、糖質（sugary）和心白（white-core）。水稻中研究最早的粉質突變體是糯性wx，其胚乳中幾乎不含直鏈淀粉，絕大多數是支鏈淀粉，Wx編碼GBSSI蛋白，主要集中在胚乳早期表達[15-16]。近年來，報道了一系列粉質突變體flo1—flo8，它們籽粒表型各異，包括粉質、皺縮、心白等等。其中flo2、flo4、flo5、flo6、flo7和flo8已經克隆，但flo1、flo3目前尚未被克隆。flo1突變體胚乳中直鏈淀粉比例上升，突變基因定位于第5染色體[17]。flo2籽粒呈現完全粉質表型，籽粒變小，胚乳中淀粉粒變小并且排列疏松，FLO2為一個包含三角形四肽重復基序的蛋白，具體功能未知[18]。FLO3突變基因定位于第4染色體，突變體籽粒中16 kD醇溶蛋白含量減少[19]。flo4和flo5籽粒均呈現心白狀胚乳，其中FLO4編碼一個丙酮酸磷酸雙激酶，主要在發育的胚乳中表達，通過調控胚乳中碳代謝來影響淀粉合成[20]；FLO5定位于第5染色體上，其編碼的蛋白為淀粉合酶亞家族SSIIIa[21]。FLO6編碼一個包含 CBM48結構域的未知功能蛋白，調控胚乳中造粉體的發育和淀粉的合成[22]。FLO7定位于第12染色體，編碼一個未知功能蛋白[23]。FLO8定位于第9染色體上，其編碼的蛋白為UDP-葡萄糖焦磷酸化酶1（Ugp1）[24]。此外，日本科學家利用化學誘變方式，獲得 6份胚乳中淀粉顆粒異常的粉質突變體ssg1—ssg6。其中ssg1—ssg3胚乳中淀粉顆粒都變小，而ssg4和ssg6胚乳中淀粉顆粒變大，ssg5胚乳中沒有正常的淀粉顆粒。通過克隆和表型分析，發現ssg1—ssg3都是ae的等位突變體。目前SSG5還未被克隆，而SSG4編碼一個功能未知的蛋白，定位于造粉體；而SSG6則編碼一個轉氨酶的同源蛋白，定位于造粉體膜上[25]。以上突變體的發現和相關基因的克隆，為更全面地闡釋淀粉生物合成途徑奠定了基礎。【本研究切入點】目前，水稻胚致死及胚乳中淀粉合成和調控的分子機理尚未完全闡明，挖掘更多的粉質突變體，有助于進一步解析胚致死及胚乳淀粉形成的機制，為提高稻米品質奠定基礎。【擬解決的關鍵問題】本研究以從化學誘變劑N-甲基-N-亞硝基脲（MNU）處理的粳稻品種寧粳3號突變體庫中篩選到的一個穩定遺傳的胚乳粉質致死fse3突變體為材料，對該突變體的形態學特征及各種理化性質進行詳細的分析與描述，同時對突變基因進行精細定位，并檢測突變基因對淀粉合成相關基因表達的影響，為胚致死及淀粉合成機制的進一步研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料種植

fse3是粳稻品種寧粳 3號 2015年 7月經 1 mmol·L-1N-甲基-N-亞硝基脲（MNU）誘變后從中篩選得到的粉質皺縮突變體材料，其胚乳突變性狀穩定遺傳。2016年3月在海南陵水實驗基地將其與9311配制雜交組合，5月份收獲F1。5月底將F1播種于南京農業大學水稻研究所土橋實驗基地，9月份得到F2群體，挑選F2群體中隱性極端個體用于精細定位。所有材料種植管理方式同大田生產。

1.2 成熟種子理化性質測定

從突變體雜合植株上分離粉質成熟種子，去粰殼后磨成糙米粉進行測定。按照農業部標準 NY147-88進行表觀直鏈淀粉含量測定；總淀粉含量使用Megazyme總淀粉測定試劑盒測定；使用 FOSS公司Kjeltec2300型全自動凱氏定氮儀測定總蛋白含量；參照NISHI等[26]方法測定尿素膨脹；按照HAN等[27]的方法測定支鏈淀粉鏈長分布（聚合度）；采用瑞典波通公司（Perten）的快速黏度分析儀（RVA）測定米粉的黏度特性[28]。每個樣品重復3次，取平均值。

1.3 TTC染色

2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride，TTC）和活細胞線粒體內的琥珀酸脫氫酶反應，生成紅色的甲臜，用來表征種子呼吸相關脫氫酶活性。取種子20粒，去粰殼，在30℃條件下清水浸種24 h，設置3次重復。浸種完畢后，用濾紙吸干種子表面水分，放入10 mL試管，加入8 mL事先用磷酸緩沖液配置好的0.5%TTC染液，在35℃黑暗條件下染色2 h。最后用蒸餾水沖洗3次，吸干水分，進行拍照。

1.4 成熟種子橫切面的掃描電鏡觀察

掃描電鏡觀察參照前人方法進行[29]。將成熟籽粒橫斷后置于 3%戊二醛溶液中室溫浸泡 3 h，用 0.1 mol·L-1的磷酸鈉溶液（pH 6.8）沖洗，每次 15 min；沖洗3—5次，然后用2%四氧化鋨溶液4℃固定過夜，固定后的樣品用磷酸鈉溶液沖洗 2—3次，每次 15 min；再用70%、80%、95%和100%乙醇溶液進行梯度脫水，每個梯度5 min，然后在乙醇：異戊基醋酸（v/v= 1:3）混合液中浸泡1 h，取出干燥，用金粉包裹，用日立S-3000N型掃描電子顯微鏡觀察（加速電壓為10—20 kV）。

1.5 胚乳半薄切片觀察

分別從野生型和突變體雜合植株上取花后12 d的發育胚乳，切成厚度～1 mm薄片，置于固定液（多聚甲醛 2%（W/V），戊二醛 2%（V/V），蔗糖 250 mmol·L-1，PIPES-KOH 50 mmol·L-1，pH7.2）中，固定 12 h 后 PBS漂洗3次，在4℃依次用30%、50%乙醇對樣品進行脫水處理，每次15 min。然后在-20℃中用70%乙醇對樣品脫水處理2次，每次30 min。接著在-20℃中，依次用LR White樹脂:70%乙醇溶液（2:1）、100% LR White樹脂對樣品進行滲透，每次2 h，最后用純樹脂滲透12 h后，將樣品放入60℃烘箱中聚合48 h。采用Leica RM2265切片機上切成1 μm厚的薄片，最后用1% I2-KI溶液染色后在顯微鏡下觀察并拍照。

表1 突變體基因FSE3的精細定位所用分子標記Table 1 Markers for fine mapping of FSE3

1.6 基因的圖位克隆

配制fse3與9311的雜交組合，在F1植株上收取F2種子，挑選其中與fse3突變體一樣表現為粉質不透明的 F2種子用于基因定位，采用 CTAB法提取種子DNA。篩選9311和fse3之間的多態性標記，并用10個極端個體進行連鎖分析。確定連鎖標記后，在定位區間開發新標記，并擴大群體進行精細定位。利用Gramene網站（www.gramene.org）預測精細定位區間內的開放閱讀框（open reading frame，ORF），用Primer Premier5.0軟件設計引物（表1），擴增ORF的編碼區并測序，測序由南京金斯瑞公司完成。

1.7 淀粉合成相關基因的表達分析

分別從野生型和突變體雜合植株上取花后12 d的胚乳，使用TIANGEN公司的植物總RNA提取試劑盒提取RNA，反轉錄得到cDNA后使用SYBR?Green Master Mix（Applied Biosystems, Foster, CA, USA）進行實時熒光定量PCR，儀器為Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System，以水稻Actin作為內參（表2）。反應體系為cDNA模板2.0 μL、2×SYBR Premix Ex TaqⅡ 10 μL、前后引物（10 μmol·L-1）各 0.8 μL、50×ROX Reference Dye 0.4 μL 和 ddH2O 6.0 μL。反應程序采用兩步法：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。采用 2-ΔΔCT計算方法處理數據。

1.8 蛋白Western-blot分析

提取野生型以及從突變體雜合植株上摘取的花后12 d胚乳總蛋白進行SDS-PAGE。濃縮膠濃度為6%，分離膠使用8%—18%的梯度膠。采用Bio-Rad公司的濕轉系統轉膜。將轉印后的PVDF膜（Minipore，0.45 μm）放入封閉液中孵育1 h，然后轉移至一抗溶液中（1:1000），室溫孵育2 h；接著用PBST溶液漂洗3次，每次15 min；再將PVDF膜轉移至二抗溶液中（1:5000），室溫孵育1 h后，重復上述漂洗過程；最后用 ECL化學發光液檢測雜交信號。抗體由ABclonal公司制備，內參抗體為 Sigma公司的Anti-actin單克隆抗體。

表2 實時熒光定量PCR分析所用的引物Table 2 Primers used in real-time PCR analysis

2 結果

2.1 fse3突變體表型及農藝性狀分析

fse3突變體，是粳稻品種寧粳3號經化學誘變（1 mmol·L-1MNU處理）后篩選得到的能穩定遺傳的胚乳突變體，其成熟籽粒去殼后呈現粉質皺縮不透明狀，而寧粳3號成熟籽粒胚乳為透明狀（圖1-A和圖1-B）。利用掃描電鏡觀察fse3突變體和野生型成熟籽粒的橫截面，發現野生型種子淀粉顆粒排列緊密，大小均勻，且淀粉顆粒呈現規則多面體結構。而fse3突變體種子橫斷面淀粉顆粒排列疏松，大小不均勻，顆粒間存在較大間隙，且單粒型淀粉顆粒較多，呈橢圓形（圖1-C和圖1-D），這些表型說明fse3突變體的淀粉合成過程出現異常，導致淀粉的結構發生了改變。與野生型相比，fse3突變體成熟籽粒的粒厚顯著降低，而粒長和粒寬沒有顯著變化。成熟后突變體籽粒千粒重顯著降低，僅為野生型千粒重的 64%（圖1-E和圖1-F）。

2.2 fse3突變體種子的胚致死觀察

fse3突變體與野生型相比，fse3突變體不能萌發，TTC染色表明突變體胚沒有活力（圖2-A和圖2-B）。因此，該突變體為純合致死，只能以雜合體保存。對放置在30℃培養箱9 h后的野生型和突變體種子胚的縱切片進行觀察，發現野生型已有正常完整的心型胚的分化，而在突變體中未見有胚胎分化的痕跡，說明該突變造成了胚發育缺陷。

2.3 fse3突變體成熟籽粒的理化性質分析

與野生型寧粳3號成熟種子相比，fse3突變體總淀粉含量、表觀直鏈淀粉含量顯著降低，分別為野生型的90%和85%，而總蛋白含量無明顯差異（圖3-A—圖3-C）。為進一步分析突變體中支鏈淀粉結構，對fse3突變體和野生型的支鏈淀粉的鏈長分布進行測定，結果表明，fse3突變體與野生型相比，fse3突變體聚合度（degree of polymerization，DP）為7—12的支鏈分支比例增加，同時，DP 13—15支鏈比例減少，說明fse3突變體中支鏈淀粉的精細結構發生了變化。（圖3-D）。尿素的溶解性分析發現fse3突變體的米粉較野生型米粉更難溶解于尿素當中，且在尿素濃度為4 mol·L-1時開始表現出顯著差異（圖3-E和圖3-F）。另外，利用黏度分析儀測定fse3突變體和野生型的胚乳淀粉黏度曲線，結果顯示，fse3突變體淀粉的黏度曲線與野生型差異顯著。fse3突變體的最高黏度（peak paste viscosity，PKV）、熱漿黏度（hot paste viscosity，HPV）、冷漿黏度（cool paste viscosity，CPV）以及崩解值（break down viscosity，BDV=PKV-HPV）都顯著高于野生型（圖3-G和圖3-H）。說明FSE3的突變影響了淀粉的理化性質。

圖1 野生型與fse3突變體表型比較Fig. 1 Phenotypic characterization of the wild type and fse3 mutant

圖2 野生型與fse3突變體種子的胚致死觀察Fig. 2 Embryo lethality observation of wild type and fse3 mutant seeds

圖3 野生型與fse3突變體成熟籽粒的理化性質分析Fig. 3 Physicochemical characteristics of wild-type and fse3 mature seeds

2.4 fse3胚乳發育過程中淀粉結構的半薄切片觀察

制備了fse3突變體及野生型寧粳3號開花后12 d發育胚乳的半薄切片，并用0.1% I2-KI染色觀察。結果發現，在野生型寧粳3號發育胚乳細胞中，淀粉顆粒均為典型的復合淀粉顆粒（compound starch grains），其由多個單粒淀粉顆粒（starch granules），且排列規整，幾乎觀察不到間隙（圖4-A—圖4-C）。而在fse3突變體的發育胚乳細胞中，復合淀粉顆粒較少，單粒型淀粉顆粒較多，排列疏松，淀粉顆粒間隙較野生型更大（圖4-D—圖4-F）。綜上所述，fse3突變體胚乳發育過程中淀粉顆粒的形成出現異常。

圖4 野生型與fse3突變體胚乳的半薄切片觀察結果Fig. 4 Semi-thin sections of developing endosperm of wild type and fse3

2.5 FSE3的遺傳分析和精細定位

考察雜合植株成熟種子表型分離比（表3），結果顯示，正常透明種子和粉質皺縮兩種類型種子的性狀分離比符合3:1的比例，說明突變性狀受1對隱性主基因控制，該基因暫命名為FSE3（Floury and Shrunken Endosperm3）。

由于fse3純合致死，故挑選雜合單株（FSE3fse3）與秈稻品種 9311配制雜交組合，F1自交后獲得 F2種子，從中挑選粉質不透明極端個體，用于FSE3基因的定位。篩選出9311與fse3之間具有多態性的SSR標記，從中挑選出均勻分布于12條染色體的標記，間距在10—15 cM。并利用22個隱性極端個體將該基因初步連鎖在第9染色體長臂上，分子標記09-019和N9-21之間，遺傳距離大約14 cM（圖5-A），進一步利用1 400個極端個體將FSE3定位于分子標記YF-3和10711之間，物理距離約228 kb（圖5-B）。通過 NCBI和 Gramene網站預測，該區域包含 28個ORFs（表4）。

表3 雜合植株種子不同性狀分離比Table 3 Segregation of heterozygous plants seeds of different phenotypes

表4 候選區域內的28個開放閱讀框Table 4 Twenty eight open reading frames in the mapping interval

圖5 突變基因FSE3的精細定位Fig. 5 Fine-mapping of FSE3

2.6 FSE3的突變影響了發育胚乳中淀粉合成相關基因的表達和蛋白積累

通過比較開花后12 d的野生型與突變體胚乳中編碼淀粉合成相關基因的表達水平發現，與野生型相比，fse3突變體中編碼淀粉合成相關基因的表達量絕大部分呈不同程度的下降，包括淀粉合成的限速酶AGPase各亞基的編碼基因，只有少部分基因表達量不變或上調（圖6-A—圖6-B）。提取開花后12 d胚乳中的總蛋白進行免疫印跡分析，發現fse3突變體中影響淀粉合成的相關蛋白水平顯著降低（圖6-C）。因此，FSE3的突變嚴重影響了發育胚乳中淀粉合成，造成胚乳粉質皺縮。

3 討論

稻米提供了人類尤其是亞洲人所需的大部分能量和較多的蛋白質營養，同時也是畜牧業和食品加工等行業的重要原料[30]。因此，稻米的產量與品質直接關系到人們的營養狀況和身體健康。淀粉的含量、組成及結構是決定稻米品質的主要因素[31]。水稻粉質形成是由于籽粒胚乳灌漿時期淀粉和貯藏蛋白不充實，相互間存在空隙而形成的一種光學特性[32]。目前已經有多個粉質胚乳突變體的研究報道，如粉質flo4突變體相對于其野生型，總淀粉含量不變，蛋白質含量增加，直鏈淀粉含量降低[20]；flo6突變體相對于其野生型，總淀粉和直鏈淀粉含量顯著下降，而蛋白質和脂肪含量顯著增加[22]。本研究發現的fse3突變體相對于野生型，粒長和粒寬不變，粒厚、千粒重、總淀粉含量和直鏈淀粉含量都顯著降低（圖1和圖3）。因此，研究粉質胚乳突變體有助于進一步發現稻米品質及粒重的形成和調控的分子機制。

淀粉和蛋白質是構成水稻胚乳的主要組分，因此淀粉和蛋白質的組分及結構發生改變往往會造成粉質胚乳的表型[33]，同時也會影響淀粉合成相關基因的表達，如粉質flo2突變體中大部分淀粉合成相關基因的表達量都降低了[18]。在本研究中，粉質fse3突變體胚乳中的淀粉合成相關基因表達同樣受到不同程度的影響，這可能是導致總淀粉含量降低的原因。其中，GBSSI的表達量下調推測是導致fse3直鏈淀粉含量降低的直接原因。淀粉和貯藏蛋白在籽粒灌漿過程中快速積累，如果淀粉或蛋白的合成或調控相關基因發生突變均可能導致胚乳粉質狀。如AGPL2突變造成胚乳粉質和籽粒皺縮[34]；谷蛋白前體增加突變體gpa1、gpa2、gpa3、gpa4胚乳均為粉質[35-38]；還有一些不直接涉及淀粉和蛋白合成的基因，它們的突變同樣能造成胚乳粉質。如FLO2參與調控淀粉和貯藏蛋白合成相關基因的表達，flo2突變體籽粒變小、胚乳粉質、直鏈淀粉含量降低[18]。ssg4和ssg6都是定位于造粉體上的基因，參與調控淀粉顆粒大小，它們的突變導致胚乳中淀粉顆粒發育異常從而形成粉質胚乳[25]。雖然，目前已經報道了較多的粉質胚乳突變體，但是粉質胚乳形成的分子機理仍然不是十分清楚，因此還需要克隆更多的相關基因并對其功能進行研究。本研究以粉質胚乳fse3突變體為材料，將基因定位在第9染色體長臂上（圖4），與之前報道的粉質胚乳相關基因的位點均不相同。通過精細定位，FSE3被定位于約228 kb的區間內，該區間包含28個ORFs（表3）。其中，ORF20編碼的是天冬氨酸轉氨酶，是天冬氨酸代謝途徑關鍵酶基因。天冬氨酸是組成蛋白質的重要氨基酸如賴氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸等合成的共同的前體分子[39]。轉基因研究表明轉化外源或自身天冬氨酸轉氨酶基因可以使擬南芥、水稻種子中氨基酸和蛋白質含量都顯著增加[40]。重測序發現該基因啟動子區發生了單堿基替換，但是突變體候選基因是否是該基因還有待進一步轉基因驗證。本研究結果為FSE3的最終克隆及功能研究打下基礎，后續研究將有助于更深入了解淀粉合成、代謝的調控機理。

圖6 野生型和fse3中淀粉合成相關基因表達和蛋白積累Fig. 6 Gene expression and protein accumulation analyses of starch biosynthesis related genes in wild type and fse3

胚致死（embryo lethality）突變表現為其突變體的胚胎會在特定時期發育失敗，從而使種子喪失發芽能力。這種突變可以自發產生，也可由人工誘發獲得。已知的胚致死突變多數是誘發產生的，EMS（Ethyl methane-sulfonate）、MNU（N-methyl-N-nitrosourea）及EMS配合X-射線均已用于誘發這種突變，用于誘變處理的材料有種子、花粉及受精卵細胞等[35]。由于突變的性質所致，純合突變體胚胎不能正常發育，所以純合胚致死突變的植株無法用常規方法獲得。這種突變在玉米、擬南芥、胡蘿卜及水稻中均有報道[41-44]。GAVAZZI等[42]在玉米中發現一種胚發育營養缺陷型突變，需要為其補充脯氨酸來完成正常的胚胎發育。GABOTTI等[45]和GUTIERREZ-MARCOS等[46]發現玉米突變體中編碼PPR蛋白的基因EMP4（empty pericarp4）突變導致種子純和致死，突變體的胚乳嚴重受損，胚乳傳遞細胞高度不規則分化。利用胚挽救實驗也未能得到成熟的純合突變體植株。擬南芥中發現了至少 250個胚缺陷基因（embryo-defective genes，EMBs）為胚正常發育所不可或缺，其中LEC2（leafy cotyledon2）編碼一個含 B3結構域的轉錄因子，負責調控胚發育的正確啟動[47]，GNOM編碼鳥苷酸交換因子（GEF），它通過激活G型蛋白-ADP核糖基化因子（ARF）來影響合子的第一次分裂[48]。因此，造成胚胎致死的原因多種多樣。我們以化學誘變劑MNU處理粳稻品種寧粳3號開花20 h的受精卵誘發獲得水稻胚致死突變fse3，TTC染色表明其胚活力下降，對發育中的胚縱切片觀察發現突變體沒有心型胚的分化。胚致死的分子遺傳機理還有待基因克隆后進一步分析，該突變體為胚致死突變分子遺傳機理的研究提供了良好的材料。

之前報道很多胚致死突變體都伴隨有粉質表型，例如玉米突變體emp4、emp9和emp16。擬南芥基因AtTIM9或AtTIM10的功能障礙導致早期孢子體致死表型，在16/32細胞階段，由于線粒體結構和活性的破壞引起細胞程序性死亡進而導致胚胎和胚乳都會停止分裂[49]。最近，也有研究發現，在水稻大多數胚致死的種子中，胚乳核分裂的次數有限。游離核僅分布在胚囊的珠孔端，并且其定向定位被阻斷，此外其糊粉分化出現中斷[50]。但是，在玉米胚致命突變體（lem1）中，其胚胎在轉變期之前發育中止，但胚乳卻正常發育[51]。FSE3突變既造成了胚乳粉質的表型又導致胚致死，但是胚致死和胚乳粉質之間有無關聯還有待考證。

4 結論

胚乳粉質皺縮致死fse3突變體籽粒的千粒重、籽粒大小、總淀粉含量、直鏈淀粉含量等指標的降低，及淀粉在尿素溶液中的膨脹能力減弱等變化是由于fse3突變體中FSE3的突變影響了造粉體的發育，進而造成了淀粉合成積累的缺陷。利用fse3/9311 F2群體，將FSE3定位在第9染色體長臂228 kb的區間內，這與之前報道的粉質胚乳突變體基因及胚致死突變體基因的染色體位置均不相同，推測FSE3是一個新的調控胚及胚乳發育的基因。

致謝：農業部長江中下游粳稻生物學與遺傳育種重點實驗室/江蘇省現代作物生產中心/長江流域雜交水稻協同創新中心在研究中給予了幫助，在此表示感謝。

[1]潘鵬屹, 朱建平, 王云龍, 郝媛媛, 蔡躍, 張文偉, 江玲, 王益華,萬建民. 水稻粉質胚乳突變體ws的表型分析及基因克隆. 中國水稻科學, 2016, 30(5): 447-457.PAN P Y, ZHU J P, WANG Y L, HAO Y Y, CAI Y, ZHANG W W,JIANG L, WANG Y H, WAN J M. Phenotyping and gene cloning of a floury endosperm mutantwsin rice.Chinese Journal of Rice Science,2016, 30(5): 447-457. (in Chinese)

[2]WOO M O, HAM T H, JI H S, CHOI M S, JIANG W, CHU S H,PIAO R, CHIN J H, KIM J A, PARK B S, SEO H S, JWA N S,MCCOUCH S, KOH H J. Inactivation of theUGPase 1gene causes genic male sterility and endosperm chalkiness in rice (Oryza sativaL.).The Plant Journal, 2008, 54(2): 190-204.

[3]LI Y B, FAN C C, XING Y Z, YUN P, LUO L J, YAN B, PENG B,XIE W B, WANG G W, LI X H, XIAO J H, XU C G, HE Y Q.Chalk5encodes a vacuolar H+-translocating pyrophosphatase influencing grain chalkiness in rice.Nature Genetics, 2014, 46(4):398-404.

[4]HIROSE T, TERAO T. A comprehensive expression analysis of the starch synthase gene family in rice (Oryza sativaL.).Planta, 2004,220(1): 9-16.

[5]KAWASAKI T, MIZUNO K, BABA T, SHIMADA H. Molecular analysis of the gene encoding a rice starch branching enzyme.Molecular Genetics and Genomics, 1993, 237(1/2): 10-16.

[6]KAWAGOE Y, KUBO A, SATOH H, TAKAIWA F, NAKAMURA Y. Roles of isoamylase and ADP-glucose pyrophosphorylase in starch granule synthesis in rice endosperm.The Plant Journal, 2005, 42(2):164-174.

[7]HANASHIRO I, ITOH K, KURATOMI Y, YAMAZAKI M,IGARASHI T, MATSUGASAKO J, TAKEDA Y. Granule-bound starch synthase I is responsible for biosynthesis of extra-long unit chains of amylopectin in rice.Plant and Cell Physiology, 2008, 49(6):925-933.

[8]MYERS A M, MORELL M K, JAMES M G, BALL S G. Recent progress toward understanding biosynthesis of the amylopectin crystal1.Plant Physiology, 2000, 122(4): 989-998.

[9]SHIMADA H, TADA Y, KAWASAKI T, FUJIMURA T.Antisense regulation of the rice waxy gene expression using a PCR-amplified fragment of the rice genome reduces the amylose content in grain starch.Theoretical and Applied Genetics, 1993,86(6): 665-672.

[10]GAO M, FISHER D K, KIM K N, SHANNON J C, GUILTINAN M J. Evolutionary conservation and expression patterns of maize starch branching enzyme I and IIb genes suggests isoform specialization.Plant Molecular Biology, 1996, 30(6): 1223-1232.

[11]HAMADA S, NOZAKI K, ITO H, YOSHIMOTO Y, YOSHIDA H,HIRAGA S, ONODERA S, HONMA M, TAKEDA Y, MATSUI H.Two starch-branching-enzyme isoforms occur in different fractions of developing seeds of kidney bean.Biochemical Journal, 2001, 359(Pt 1): 23-34.

[12]SATOH H, NISHI A, YAMASHITA K, TAKEMOTO Y, TANAKA Y, HOSAKA Y, SAKURAI A, FUJITA N, NAKAMURA Y.Starch-branching enzyme I-deficient mutation specifically affects the structure and properties of starch in rice endosperm.Plant Physiology,2003, 133(3): 1111-1121.

[13]FU F F, XUE H W. Coexpression analysis identifies Rice Starch Regulator1, a rice AP2/EREBP family transcription factor, as a novel rice starch biosynthesis regulator.Plant Physiology, 2010, 154(2):927-938.

[14]WANG J C, XU H, ZHU Y, LIU Q Q, CAI X L. OsbZIP58, a basic leucine zipper transcription factor, regulates starch biosynthesis in rice endosperm.Journal of Experimental Botany, 2013, 64(11):3453-3466.

[15]OHDAN T, FRANCISCO P B J, SAWADA T, HIROSE T, TERAO T, SATOH H, NAKAMURA Y. Expression profiling of genes involved in starch synthesis in sink and source organs of rice.Journal of Experimental Botany, 2005, 56(422): 3229-3244.

[16]OKAGAKI R J, WESSLER S R. Comparison of non-mutant and mutantwaxygenes in rice and maize.Genetics, 1988, 120: 1137-1143.

[17]SATOH H, OMURA T. New endosperm mutations induced by chemical mutagens in rice.Japanese Journal of Breeding, 1981, 31(3):316-326.

[18]SHE K, KUSANO H, KOIZUMI K, H YAMAKAWA, HAKATA M,IMAMURA T, FUKUDA M, NAITO N, TSURUMAKI Y, YAESHIMA M, TSUGE T, MATSUMOTO K, KUDOH M, ITOH E, KIKUCHI S,KISHIMOTO N, YAZAKI J, ANDO T, YANO M, AOYAMA T,SASAKI T, SATOH H, SHIMADA H. A novel factorFLOURY ENDOSPERM2is involved in regulation of rice grain size and starch quality.The Plant Cell, 2010, 22(10): 3280-3294.

[19]NISHIO T, IIDA S. Mutants having a low content of 16-kDa allergenic protein in rice (Oryza sativaL.).Theoretical and Applied Genetics, 1993, 86(2/3): 317-321.

[20]KANG H, PARK S, MATSUOKA M, AN G. White-core endospermfloury endosperm-4in rice is generated by knockout mutations in the C4-type pyruvate orthophosphate dikinase gene (OsPPDKB).The Plant Journal, 2005, 42(6): 901-911.

[21]RYOO N, YU C, PARK C S, BAIK M Y, PARK I M, CHO M H,BHOO S H, AN G, HAHN T R, JEON J S. Knockout of a starch synthase geneOsSSIIIa/Flo5causes white-core floury endosperm in rice (Oryza sativaL.).Plant Cell Reports, 2007, 26(7): 1083-1095.

[22]PENG C, WANG Y H, LIU F, REN Y L, ZHOU K N, LV J, ZHENG M, ZHAO S L, ZHANG L, WANG C M, JIANG L, ZHANG X, GUO X P, BAO Y Q, WAN J M.FLOURY ENDOSPERM6encodes a CBM48 domain-containing protein involved in compound granule formation and starch synthesis in rice endosperm.The Plant Journal,2014, 77(6): 917-930.

[23]ZHANG L, REN Y L, LU B Y, YANG C Y, FENG Z M, LIU Z,CHEN J, MA W W, WANG Y, YU X W, WANG Y L, ZHANG W W, WANG Y H, LIU S J, WU F Q, ZHANG X, GUO X P, BAO Y Q,JIANG L, WAN J M.FLOURY ENDOSPERM7encodes a regulator of starch synthesis and amyloplast development essential for peripheral endosperm development in rice.Journal of Experimental Botany, 2016, 67(3): 633-647.

[24]LONG W H, DONG B N, WANG Y H, PAN P Y, WANG Y L, LIU L L, CHEN X L, LIU X, LIU S J, TIAN Y L, CHEN L M, WAN J M.FLOURY ENDOSPERM8, encoding the UDP-glucose pyrophosphorylase 1, affects the synthesis and structure of starch in rice endosperm.Journal of Plant Biology, 2017, 60(5): 513-522.

[25]MATSUSHIMA R, MAEKAWA M, FUJITA N, SAKAMOTO W. A rapid, direct observation method to isolate mutants with defects in starch grain morphology in rice.Plant and Cell Physiology, 2010,51(5): 728-741.

[26]NISHI A, NAKAMURA Y, TANAKA N, SATOH H. Biochemical and genetic analysis of the effects ofAmylose-Extendermutation in rice endosperm.Plant Physiology, 2001, 127(2): 459-472.

[27]HAN X, WANG Y, LIU X, JIANG L, REN Y L, LIU F, PENG C, LI J J, JIN X M, WU F Q, WANG J L, GUO X P, ZHANG X, CHENG Z J, WAN J M. The failure to express a protein disulphide isomeraselike protein results in a floury endosperm and an endoplasmic reticulum stress response in rice.Journal of Experimental Botany,2012, 63(1): 121-130.

[28]萬向元, 陳亮明, 王海蓮, 肖應輝, 畢京翠, 劉喜, 翟虎渠, 萬建民. 水稻品種胚乳淀粉 RVA譜的穩定性分析. 作物學報, 2004,30(12): 1185-1191.WAN X Y, CHEN L M, WANG H L, XIAO Y H, BI J C, LIU X,ZHAI H Q, WAN J M. Stability analysis for the RVA profile properties of rice starch.Acta Agronomica Sinica, 2004, 30(12):1185-1191. (in Chinese)

[29]黃雅琴, 黃群策, 燕曉陽, 秦廣雍. 雙胚苗水稻種子的掃描電鏡觀察. 核農學報, 2010, 24(4): 662-667.HUANG Y Q, HUANG Q C, YAN X Y, QIN G Y. Scanning electron microscopic observation of twin-embryo seedling rice seeds.Journal of Nuclear Agricultural Sciences, 2010, 24(4): 662-667. (in Chinese)

[30]石春海, 朱軍. 稻米營養品質種子效應和母體效應的遺傳分析. 遺傳學報, 1995, 22(5): 372-379.SHI C H, ZHU J. Genetic analysis of seed nutrition and maternal effects in nutritional quality of rice.Journal of Genetics and Genomics, 1995, 22(5): 372-379. (in Chinese)

[31]鄒德堂, 趙廣欣, 孫健. 水稻淀粉合成候選基因 OsAGPL3與淀粉相關性狀的關聯分析. 東北農業大學學報, 2017, 48(9): 1-10.ZOU D T, ZHAO G X, SUN J. Association analysis on candidate geneOsAGPL3involved in synthesis of rice starch and starch related traits.Journal of Northeast Agricultural University, 2017, 48(9): 1-10.(in Chinese)

[32]金田蘊, 李輝. 水稻穩定高堊白率突變體的獲得與理化特性分析.作物學報, 2010, 6(1): 121-132．JIN T Y, LI H. Analysis of physiological and biochemical characteristics of six mutants with stable high percentage of chalkiness in rice grains.Acta Agronomica Sinica, 2010, 6(1):121-132. (in Chinese)

[33]姚東升, 宋任濤. 玉米粉質胚乳突變體的研究進展. 自然雜志,2013, 35(2): 105-111.YAO D S, SONG R T. Research progress of maize floury endosperm mutants.Chinese Journal of Nature, 2013, 35(2): 105-111. (in Chinese)

[34]TANG X J, PENG C, ZHANG J, CAI Y, YOU X M, KONG F, YAN H G, WANG G X, WANG L, JIN J, CHEN W W, CHEN X G, MA J,WANG P, JIANG L, ZHANG W W, WAN J M. ADP-glucose pyrophosphorylase large subunit 2 is essential for storage substance accumulation and subunit interactions in rice endosperm.Plant Science, 2016, 249: 70-83.

[35]REN Y L, WAN Y H, LIU F, ZHOU K N, DING Y, ZHOU F,WANG Y, LIU K, GAN L, MA W W, HAN X H, ZHANG X, GUO X P, WU F Q, CHENG Z J, WANG J L, LEI C L, LIN Q B, JIANG L,WU C Y, BAO Y Q, WANG H Y, WAN J M. GLUTELIN PRECURSOR ACCUMULATION3 encodes a regulator of post-golgi vesicular traffic essential for vacuolar protein sorting in rice endosperm.The Plant Cell, 2014, 26: 410-425.

[36]WANG Y H, LIU F, REN Y L, WANG Y L, LIU X, LONG W H,WANG D, ZHU J P, ZHU X P, JING R N, WU M M, HAO Y Y,JIANG L, WANG C M, WANG H Y, BAO Y Q, WAN J M. GOLGI TRANSPORT 1B regulates protein export from the endoplasmic reticulum in rice endosperm cells.The Plant Cell, 2016, 28:2850-2865.

[37]WANG Y H, REN Y L, LIU X, JIANG L, CHEN L M, HAN X H,JIN M N, LIU S J, LIU F, LV J, ZHOU K N, SU N, BAO Y Q, WAN J M. OsRab5a regulates endomembrane organization and storage protein trafficking in rice endosperm cells.The Plant Journal, 2010,64: 812-824.

[38]LIU F, REN Y, WANG Y, PENG C, ZHOU K, LV J, GUO X,ZHANG X, ZHONG M, ZHAO S, JIANG L, WANG H, BAO Y,WAN J. OsVPS9A functions cooperatively with OsRAB5A to regulate post-golgi dense vesicle-mediated storage protein trafficking to the protein storage vacuole in rice endosperm cells.Molecular Plant, 2013, 6: 1918-1932.

[39]王為民, 趙倩, 于靜娟, 朱登云, 敖光明. 水稻轉高賴氨酸蛋白質基因(sb401)植株的獲得及種子中蛋白質和氨基酸的含量分析. 作物學報, 2005, 31(5): 603-607.WANG W M, ZHAO Q, YU J J, ZHU D Y, AO G M. Transfer of high lysine genesb401into rice and analysis for protein and amino acid content in transgenic rice seeds.Acta Agronomica Sinica, 2005,31(5): 603-607. (in Chinese)

[40]MUROOKA Y, MORI Y, HAYASHI M. Variation of the amino acid content ofArabidopsisseeds by expressing soybean aspartate aminotransferase gene.Journal of Bioscience and Bioengineering,2002, 94(3): 225-230.

[41]凌定厚, 徐信蘭, 馬鎮榮, 陳琬瑛, 陳梅芳. 水稻純合胚致死突變研究. 遺傳學報, 1997(2): 29-33, 35-38.LING D H, XU X L, MA Z R, CHEN W Y, CHEN M F. Study on fatal mutation of homozygous embryo in rice.Journal of Genetics and Genomics, 1997(2): 29-33, 35-38. (in Chinese)

[42]GAVAZZI G, NAVA-RACCHI M, TONELLI C. A mutation causing proline requirement inZea mays.Theoretical and Applied Genetics,1975, 46: 339-345.

[43]MEINKE D W, SUSSEX I M. Embryo-lethal mutants ofArabidopsis thaliana. A model system for genetic analysis of plant embryo development.Developmental Biology, 1979, 75(1): 50-61.

[44]BRETON A M, SUNG Z R. Temperature-sensitive carrot variants impaired in somatic embryogenesis.Developmental Biology, 1982,90(1): 58-66.

[45]GABOTTI D, CAPORALI E, MANZOTTI P, PERSICO M, VIGANI G, CONSONNI G. The maize pentatricopeptide repeat geneempty pericarp4(emp4) is required for proper cellular development in vegetative tissues.Plant Science, 2014, 223: 25-35.

[46]GUTIERREZ-MARCOS J, DALPRA M, GIULINI A, COSTA L M,GAVAZZI G, CORDELIER S, SELLAM O, TATOUT C, PAUL W,PEREZ P, DICKINSON H G, CONSONNI G.empty pericarp4encodes a mitochondrion-targeted pentatricopeptide repeat protein necessary for seed development and plant growth in maize.ThePlant Cell, 2007, 19(1): 196-210.

[47]STONE S L, KWONG L W, YEE K M, PELLETIER J, LEPINIEC L,FISCHER R L, GOLDBERG R B, HARADA J J.LEAFY COTYLEDON2encodes a B3 domain transcription factor that induces embryo development.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2001, 98(20): 11806-11811.

[48]GREBE M, GADEA J, STEINMANN T, KIENTZ M, RAHFELD J U,SALCHERT K, KONCZ C, JURGENS G. A conserved domain of theArabidopsisGNOM protein mediates subunit interaction and cyclophilin 5 binding.ThePlant Cell, 2000, 12(3): 343-356.

[49]DENG Y T, ZOU W X, LI G, ZHAO J. TRANSLOCASE OF THE INNER MEMBRANE9 and 10 are essential for maintaining mitochondrial function during early embryo cell and endosperm free nucleus divisions inArabidopsis.Plant Physiology, 2014, 166:853-868.

[50]HUANG X R, PENG X B, SUN M X. OsGCD1 is essential for rice fertility and required for embryo dorsal-ventral pattern formation and endosperm development.New Phytologist, 2017, 215: 1039-1058.

[51]MA Z R, DOONER H K. A mutation in the nuclear-encoded plastid ribosomal protein S9 leads to early embryo lethality in maize.The Plant Journal, 37(1): 92-103.