蕎麥mate的克隆及表達分析

常雪玲，張宗文，李艷琴，高佳

（1山西大學生物技術研究所，太原030006；2中國農業科學院作物科學研究所，北京100081；3國際生物多樣性中心中國辦事處，北京100081）

0 引言

【研究意義】轉運蛋白（transport protein）是膜蛋白的一大類，介導生物膜內外的化學物質以及信號交換。多藥物和有毒化合物外排家族（multidrug and toxic compound extrusion family，MATE），屬于次級轉運蛋白家族，是生物中5類解毒輸出轉運蛋白家族之一[1]。近年來，越來越多的遺傳學、生物化學和分子生物學研究表明 MATE轉運蛋白參與植物類黃酮運輸。原花青素（proanthocyanidin，PA）是植物酚類物質中普遍存在的組分之一，在植物界廣泛存在，呈現出多樣的生物和生物化學活性[2-6]，并對人體健康有潛在的有益作用[7-11]。蕎麥屬于蓼科蕎麥屬植物，是一種具有很高食用價值和醫療保健作用的經濟作物，也是一種極具開發潛力的功能性食品原料。蕎麥mate的研究為解析 MATE轉運蛋白家族在蕎麥次生代謝產物運輸和逆境脅迫中的作用奠定基礎?！厩叭搜芯窟M展】MATE轉運蛋白首先在副溶血性弧菌和大腸桿菌中被發現，功能為多藥物排出，但由于與其他轉運蛋白缺乏序列同源性而被認定為新的轉運蛋白家族并命名為MATE家族[12-13]。隨著研究深入，研究學者發現MATE家族成員分布廣泛，遍布古細菌、細菌、酵母、動物和植物，且家族直系同源成員較多，如研究發現擬南芥中至少有56個MATE家族基因[14]，亞洲棉中有 34個，雷蒙德氏棉中有42個[15]?，F階段對于 MATE家族大多數成員的功能知之甚少，已研究得到的植物中 MATE型轉運蛋白的功能涉及異生物外排，次生代謝物包括生物堿和類黃酮的積累、鐵（Fe3+）易位、鋁（Al3+）解毒和植物激素信號傳導等[16]。擬南芥tt12編碼一種類黃酮循環必需的、屬于MATE家族的多藥次生類轉運蛋白，其生物學功能是將胞漿內合成的花青素、原花青素等多酚類色素的單體物轉運到液泡等亞細胞器官中，然后花青素在酸性條件下顯色或原花青素進一步聚合后形成有色色素[17]；參與Al3+解毒的MATE轉運蛋白首先在高粱（Sorghum bicolor，SbMATE）和大麥（Hordeum vulgare，HvAACT1）中被鑒定；它們的基因表達水平與從根部釋放的檸檬酸的量以及在Al3+存在下的根伸長率相關，表明這些 MATE轉運蛋白的高表達對于Al3+耐受是必需的[18-20]。擬南芥Atfrd3編碼MATE型轉運蛋白負責將檸檬酸鹽（Fe的螯合劑）轉運到根木質部以高效地轉運鐵[21]。【本研究切入點】蕎麥種子轉錄組測序中[22]，發現mate注釋的unigene共有54個。但MATE在蕎麥中的研究報道較少，只有 LEI等[23]在蕎麥中發現2個mate——FeMATE1和FeMATE2，并通過功能分析得到兩者與蕎麥中 Al離子脅迫相關?！緮M解決的關鍵問題】本研究擬通過RACE的方法從蕎麥中克隆2條mate全長，并對其功能進行驗證，以期為篩選高營養成分含量和抗逆性較強的種質資源提供依據。

1 材料與方法

1.1 植物材料

試驗所用材料為普通蕎麥（FagopyrumesculentumMoench），來自國家中期種質庫（No.000677），于2016年9月栽培于中國農業科學院作物科學研究所溫室中。采集成株期的根、莖、葉、花苞和花及開花后7、14、21和28 d的籽粒經液氮速凍后于-80℃保存，用于總RNA的提取。

1.2 總RNA的提取和cDNA的合成

取液氮中保存的材料約 100 mg，采用 RNeasy Plant Mini Ki（tQIAGEN，USA）提取植物樣品總RNA。參照QuantiTect Reverse Transcription Kit（QIAGEN，USA）說明書，以純化好的2 μg RNA為模板逆轉錄合成cDNA，保存于-20℃備用。

1.3 蕎麥mate全長cDNA克隆

用 BLAST在線網上工具對蕎麥轉錄組測序已獲得的部分mate序列與其他物種已發表的基因序列進行比對，選取保守區域設計引物擴增合成cDNA中間片段，引物序列信息列于表1，擴增產物經電泳回收純化后連接pMD19-T載體并轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，經藍白斑篩選重組子，挑取陽性克隆送至生工（上海生物工程股份有限公司）測序，并在 NCBI數據庫中比對分析測序結果。

以獲得的cDNA中間片段為模板，設計蕎麥mate的RACE用特異引物（表1）。根據SMARTer RACE 5′/3′ Kit（TaKaRa, Dalian）說明書進行巢式 PCR 擴增。利用 DNAMAN軟件將mate的 5′端序列和 3′端序列以及中間cDNA序列進行拼接獲得蕎麥mate全長cDNA序列。參照拼接所得cDNA序列設計引物（表1），以cDNA為模板擴增出mate全長cDNA序列。

表1 蕎麥mate克隆所用引物序列信息Table 1 Sequence information of primers used for cloning buckwheat mate gene

1.4 蕎麥mate生物信息學分析

利用DNAMAN軟件搜索并翻譯mate的ORF區域，得到的氨基酸序列與已發表的其他物種基因編碼的氨基酸序列進行同源分析。利用 MEGA軟件中的NJ法構建蕎麥MATE蛋白與其他物種MATE的系統發育樹。通過ExPASy中的protparam對MATE蛋白的分子量及等電點進行預測；利用ProtScale對該蛋白的氨基酸序列進行疏水性分析；利用 TMHMMv對MATE蛋白的跨膜區域進行預測；利用SOPMA預測MATE蛋白的二級結構。

1.5 qRT-PCR分析

依據Fett12cDNA序列設計引物 FeTT12-RTF/FeTT12-RT-R（表1），以蕎麥根、莖、葉、花和花苞，開花后7、14、21和28 d的種子材料cDNA為模板進行PCR擴增，以檢測各部分Fett12的表達水平，以H3為內參基因，每個樣品重復3次。

1.6 蕎麥原花青素（PAs）含量的測定

參照吳楠等[24]DMACA-HCl的方法測定蕎麥花苞、花及不同發育階段種子中可溶的和不可溶的PA含量。取組織凍干樣品100 mg，加入10 mL甲醇，超聲波萃取1 h，其間每隔20 min旋渦震蕩1 min，4 500 r/min離心10 min，上清即為可溶的PAs；用10 mL含有1% HCl的甲醇重懸沉淀，60℃水浴1 h；水浴后，4℃ 4 500 r/min離心10 min，上清即為不溶性的PA。采用分光光度法對原花青素含量進行測定，以兒茶素標品為對照，作標準曲線。分別取200μL含有原花青素的提取液和2.8 mL的反應液（含有0.1% DMACA和5% HCl的甲醇溶液）加入5 mL離心管中，室溫下反應15 min，然后測定643 nm的吸光度，原花青素的含量參照兒茶素的標準曲線進行計算。

2 結果

2.1 蕎麥mate克隆

利用RACE克隆的方法，從蕎麥中獲得2條mate全長cDNA序列，分別命名為Fett12和Femate3。核苷酸序列分析表明，Fett12的全長cDNA為1 707 bp，包含69 bp的5'非翻譯區，159 bp的3'非翻譯區和1 479 bp的開放閱讀框；Femate3全長cDNA為2 163 bp，包含1 548 bp的開放閱讀框、387 bp的5'非翻譯區和228 bp的3'非翻譯區。通過ExPASy中的protparam在線分析得到Fett12編碼一個含有492個氨基酸殘基的假定蛋白，其分子量為 53.81 kD，等電點為 6.75；Femate3編碼一個含有516個氨基酸殘基的假定蛋白，分子量為56.12 kD，等電點為6.52。進一步對其疏水性，跨膜區域及二級結構分析預測（圖1），Fett12編碼的假定蛋白二級結構主要以 α螺旋為主，占44.51%，含有10個跨膜結構域；Femate3編碼的假定蛋白二級結構同樣以α螺旋為主，占54.84%，含有9個跨膜結構域。

2.2 蕎麥FeTT12和FeMATE3的系統進化與同源分析

目前，研究發現植物MATE型轉運蛋白的轉運底物有煙堿、原花青素、花青素、檸檬酸鹽、脫落酸等，并以此發揮不同的功能[1]。本研究選取已發表的其他物種的原花青素MATE轉運蛋白、花青素MATE轉運蛋白、檸檬酸鹽MATE轉運蛋白的氨基酸序列與克隆的2條蕎麥MATE氨基酸序列構建系統發育樹（圖2）。從圖中可以看出，選取的氨基酸序列按其功能被分成了3組，FeTT12被分到了第一組，暗示其在蕎麥中可能參與原花青素的轉運與累積。進一步將 FeTT12氨基酸序列與其他植物TT12編碼的氨基酸序列進行比對（圖3）和同源性分析（表2），得到蕎麥FeTT12與其他物種的TT12蛋白的氨基酸序列具有極高的同源性，其中與桑屬TT12蛋白同源性最高，為 77.3%；與擬南芥 TT12蛋白同源性最低，為41.5%。

圖2 FeTT12和FeMATE3系統進化樹分析Fig. 2 FeTT12 and FeMATE3 phylogenetic trees

表2 FeTT12與其他物種TT12之間的同源分析Table 2 The homology analysis of FeTT12 with TT12 from other species (%)

圖3 蕎麥Fett12與已公開其他植物tt12編碼的氨基酸序列比對Fig. 3 Amino acid sequence alignment of Fett12 gene of buckwheat with the tt12 gene of other plants

FeMATE 3被分到了第三組，暗示其功能可能與蕎麥的離子脅迫相關。通過與其他物種中轉運檸檬酸鹽的MATE型蛋白氨基酸多序列比對（圖4）及同源分析（表3），發現其與Al離子脅迫相關的蕎麥MATE蛋白FeMATE2的一致性達到96.33%，由此可以說明兩者為同一基因序列，但可能由于選用材料的不同，導致存在個別氨基酸殘基差異（紅色標注），主要集中在第二個跨膜區與第三個跨膜區之間和羧基端。

圖4 FeMATE3氨基酸序列比對圖Fig. 4 Multiple alignment of FeMATE3

表3 FeMATE3同源分析表Table 3 The homology analysis of FeMATE3 (%)

2.3 蕎麥Fett12在不同組織中的表達模式

為進一步分析FeTT12在蕎麥各個組織中相對表達量，以蕎麥的根、莖、葉、花苞、花和種子為材料進行qRT-PCR分析。結果（圖5）表明，Ftt12在蕎麥的各個組織中均有表達，其中在葉中的表達量最高。為研究Fett12在蕎麥種子不同發育階段種子中的表達模式，同時也測定了蕎麥開花后7、14、21和28 d種子中Fett12的相對表達量，結果表明，伴隨著蕎麥種子的不斷發育成熟，Fett12的相對表達量逐漸增高，在成熟期（28DPA）種子中的表達量最高。

2.4 蕎麥不同組織中PA的含量測定

基于同源分析得到FeTT12可能與原花青素的轉運和累積相關，進一步檢測蕎麥不同組織及不同發育階段種子中可溶和不可溶的PA的含量。相比其他組織，PA在蕎麥花中的含量明顯較高；在不同發育階段種子中的含量模式為隨著種子的不斷成熟，PA的含量逐漸降低；其中可溶的 PA的含量在從14DPA到21DPA階段的種子材料中下降明顯，21DPA到28DPA階段的種子材料中變化不明顯。

圖5 Fett12在蕎麥不同組織中的相對表達量Fig. 5 Relative expression of Fett12 in different tissues of buckwheat

圖6 蕎麥不同組織中可溶和不可溶的PA的含量測定Fig. 6 Determination of PAs (soluble and insoluble) in different groups of buckwheat

3 討論

3.1 蕎麥mate序列特征

研究發現，所有的MATE蛋白沒有明顯的共有保守序列，但大多數成員都具有大約40%的序列相似性[25]。在結構上，由 400—550個氨基酸殘基組成，具有12個跨膜螺旋。在蕎麥中克隆到的2條MATE蛋白，分別由492和516個氨基酸殘基組成；與其余已發表物種的 MATE蛋白的序列相似性都達到 40%及以上，編碼的假定蛋白均為疏水性極強的膜蛋白。通過進一步構建系統發育樹及同源分析，發現 2條mate被分到了不同的組里，其中一條mate為擬南芥tt12在蕎麥中的同源基因，并因此命名為Fett12；Femate3與其他物種中轉運底物為檸檬酸鹽的mate聚集到一起，并與LEI等[23]在蕎麥中發現的Al離子脅迫相關的Femate2的序列相似性達到96%，只有個別氨基酸殘基存在差異，主要集中在第二個跨膜區與第三個跨膜區之間，同時這一區段也是不同物種這一同源基因進行氨基酸序列比對時差異最多的區段。結合跨膜區預測結果分析獲得，其差異主要存在于胞內區域和跨膜區域且跨膜區域的氨基酸差異之間的極性一致。

3.2 FeTT12參與蕎麥中原花青素的累積

蕎麥是一種高黃酮含量的作物，有著與其他植物物種相似的類黃酮生物合成通路。原花青素作為合成通路中的一員，其在蕎麥中的含量，合成與轉運等被廣泛的研究。PA前體的聚合及隨后轉化為棕色氧化產物發生在液泡中，PA和花青素也積累在其中[26]。但花青素還原酶（anthocyanidin reductase，ANR）是一種可溶性胞質酶，因此，用于PA生物合成的表兒茶素或其衍生物可能具有外源性，需要一個機制將其從細胞質轉運至液泡中。擬南芥tt12編碼一個定位于液泡膜的 MATE型轉運蛋白，tt12突變體的顯微分析顯示原花青素在擬南芥內皮細胞空泡中的積累強烈減少[17]。進一步研究表明擬南芥TT12在體內功能性運輸表兒茶素 3′-O-葡萄糖苷作為原花青素合成的前體[27]。本次研究中克隆得到的Fett12為擬南芥tt12在蕎麥中的同源基因；同時，與棉花[24]、蘋果[28]、桑[29]、葡萄[30]等物種中的tt12同源基因有較高的序列相似度，因此 FeTT12有可能在蕎麥中發揮轉運原花青素前體的功能。隨后，研究了Fett12在蕎麥不同組織中的表達差異和PA的含量之間的相關性?；虮磉_模式研究表明其具有組織表達特異性，且在葉中的表達量最高；在PA的含量測定中，發現作為次級代謝產物PA的分布具有明顯的組織器官差異，且在蕎麥花中的含量明顯較高，這也與 ZIELI?SKA等[31]通過測定蕎麥莖、葉、花、未成熟與成熟種子的總黃酮及蘆丁含量，得到其在蕎麥花中的含量最高的結果一致。因之前很多研究表明，PA主要積累在植物種子中[25]，因此我們也測定了Fett12在蕎麥不同成熟階段種子中的表達量及 PA的含量變化。隨著種子的不斷成熟Fett12的表達量逐漸增高，PA的含量逐漸降低，表明兩者之間存在一定關聯。在可溶的PA的含量測定中，其在14DPA到21DPA階段的種子材料中下降明顯，可能與此階段合成結構復雜的原花青素進而轉變為不溶的PA相關。

3.3 FeMATE3與蕎麥的Al離子脅迫相關

與其他物種如小麥相比，蕎麥對Al毒害具有較高的耐受性；此外，它還在葉子中累積高Al而不會表現出毒性癥狀[32-34]。植物 MATE的功能研究中，發現MATE型轉運蛋白能通過轉運檸檬酸鹽來解除重金屬對植物的毒害。此次在蕎麥中克隆到的Femate3在系統進化分析中被歸類到檸檬酸鹽 MATE型轉運蛋白，表明其可能在蕎麥中Fe異位或Al解毒發揮重要作用。參考LEI等[23]最近發表的蕎麥中與AL脅迫相關的2條mate，通過多序列比對，發現FeMATE3與他發表的FeMATE2的氨基酸一致性達到96%，進而可以一定程度說明FeMATE3在蕎麥Al解毒方面發揮重要作用。

4 結論

從蕎麥中成功克隆獲得 2條mate——Fett12和Femate3，且Fett12與蕎麥中原花青素的轉運和累積相關。

[1]OMOTE H, HIASA M, MATSUMOTO T, OTSUKA M,MORIYAMA Y. The MATE proteins as fundamental transporters of metabolic and xenobiotic organic cations.Trends in Pharmacological Sciences, 2006, 27(11): 587-593.

[2]HE F, PAN Q H, SHI Y, DUAN C Q. Biosynthesis and genetic regulation of proanthocyanidins in plants.Molecules, 2008, 13(10):2674-2703.

[3]KOES R, VERWEIJ W, QUATTROCCHIO F. Flavonoids: A colorful model for the regulation and evolution of biochemical pathways.Trends in Plant Science, 2005, 10(5): 236-242.

[4]FEENY P. Seasonal changes in Oak leaf tannins and nutrients as a cause of spring feeding by winter moth caterpillars.Ecology, 1970,51(4): 565-581.

[5]BAIS H P, VEPACHEDU R, GILROY S, CALLAWAY R M,VIVANCO J M. Allelopathy and exotic plant invasion: From molecules and genes to species interactions.Science, 2003, 301(5638):1377-1380.

[6]RIOR R L, GU L. Occurrence and biological significant of proanthocyanidins in the american diet.Phytochemistry, 2005, 66(18):2264-2280.

[7]ZHAO M, YANG B, WANG J, LIU Y, YU L, JIANG Y.Immunomodulatory and anticancer activities of flavonoids extracted from litchi (Litchi chinensisSonn) pericarp.International Immunopharmacology, 2007, 7(2): 162-166.

[8]RAO L J, YADA H, ONO H, OHNISHIKAMEYAMA M, YOSHIDA M. Occurrence of antioxidant and radical scavenging proanthocyanidins from the Indian minor spice nagkesar (Mammea longifoliaplanch and triana syn).Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2004, 12(1): 31-36.

[9]SUBARNAS A, WAGNER H. Analgesic and anti-inflammatory activity of the proanthocyanidin shellegueain A from Polypodium feei METT.Phytomedicine International Journal of Phytotherapy &Phytopharmacology, 2000, 7(5): 401-405.

[10]Sato M, Maulik G, Ray P S, Bagchi D, Das D K. Cardioprotective effects of grape seed proanthocyanidin against ischemic reperfusion injury.Journal of Molecular & Cellular Cardiology, 1999, 31(6):1289-1297.

[11]SANO T, ODA E, YAMASHITA T, NAEMURA A, IJIRI Y,YAMAKOSHI J, YAMAMOTO J. Anti-thrombotic effect of proanthocyanidin, a purified ingredient of grape seed.Thrombosis Research, 2005, 115(1/2): 115-121.

[12]BROWN M H, PAULSEN I T, SKURRAY R A. The multidrug efflux protein NorM is a prototype of a new family of transporters.Molecular Microbiology, 1999, 31(1): 394-395.

[13]MORITA M, SHITAN N, SAWADA K, VAN MONTAGU M C E,INZE D, RISCHER H, GOOSSENS A, OKSMAN-CALDENTEY K M, MORIYAMA Y, YAZAKI K. NorM, a Putative Multidrug Efflux Protein, of Vibrio parahaemolyticus and Its Homolog in Escherichia coli.Antimicrobial Agents & Chemotherapy, 1998, 42(7): 1778-1782.

[14]LI L, HE Z, PANDEY G K, TSUCHIYA T, LUANET S. Functional cloning and characterization of a plant efflux carrier for multidrug and heavy metal detoxification.Journal of Biological Chemistry, 2002,277(7): 5360-5368.

[15]沈知臨, 許磊, 陳文, 吳楠, 蔡永萍, 林毅, 高俊山. 亞洲棉和雷蒙德氏棉MATE基因家族生物信息學及其同源基因在陸地棉中的表達分析. 棉花學報, 2016, 562(3): 215-226.SHEN Z L, XU L, CHEN W, WU N, CAI Y P, LIN Y, GAO J S.Bioinformatic analysis of the multidrug and toxic compound extrusion gene family inGossypium arboreumandGossypium raimondii, and expression of orthologs inGossypium hirsutum.Cotton Science,2016,562(3): 215-226. (in Chinese)

[16]TAKANASHI K, SHITAN N, YAZAKI K. The multidrug and toxic compound extrusion (MATE) family in plants.Plant Tissue Culture Letters, 2014, 31(5): 417-430.

[17]MARINOVA K, POURCEL L, WEDER B, SCHWARZ M, BARRON D, ROUTABOUL J M, DEBEAUJON I, KLEIN M. TheArabidopsisMATE transporter TT12 acts as a vacuolar flavonoid/H+-antiporter active in proanthocyanidin-accumulating cells of the seed coat.The Plant Cell, 2007, 19(6): 2023-2038.

[18]SIVAGURU M, LIU J, KOCHIAN L V. Targeted expression of SbMATE in the root distal transition zone is responsible for sorghum aluminum resistance.Plant Journal for Cell & Molecular Biology,2013, 76(2): 297-307.

[19]MAGALHAES J V, LIU J, GUIMAR?ES C T, LANA U G, ALVES V M, WANG Y H, SCHAFFERT R E, HOEKENGA O A,PI?EROS M A, SHAFF J E, KLEIN P E, CARNEIRO N P, COELHO C M,TRICK H N, KOCHIAN L V. A gene in the multidrug and toxic compound extrusion (MATE) family confers aluminum tolerance in sorghum.Nature Genetics, 2007, 39(9): 1156-1161.

[20]FURUKAWA J, YAMAJI N, WANG H, MITANI N, MURATA Y,SATO K, KATSUHARA M, TAKEDA K, MA J F. An aluminumactivated citrate transporter in barley.Plant & Cell Physiology, 2007,48(8): 1081-1091.

[21]DURRETT T P, GASSMANN W, ROGERS E E. The FRD3-mediated efflux of citrate into the root vasculature is necessary for efficient iron translocation.Plant Physiology, 2007, 144(1): 197-205.

[22]Gao J, Wang T T, Liu M X, Liu J, Zhang Z W. Transcriptome analysis of filling stage seeds among three buckwheat species with emphasis on rutin accumulation.Plos One, 2017, 12(12):e0189672.

[23]LEI G J, YOKOSHO K, YAMAJI N, MA J F. Two MATE transporters with different subcellular localization are involved in Al tolerance in buckwheat.Plant & Cell Physiology, 2017, 58(12): 2179-2189.

[24]GAO J S, WU N, SHEN Z L, LV K, QIAN S H, GUO N, SUN X,CAI Y P, LIN Y. Molecular cloning, expression analysis and subcellular localization of a Transparent Testa 12 ortholog in brown cotton (Gossypium hirsutumL.).Gene, 2016, 576(2): 763-769.

[25]WANG L, BEI X, GAO J, LI Y, HU Y. The similar and different evolutionary trends of MATE family occurred between rice andArabidopsis thaliana.BMC Plant Biology, 2016, 16(1): 207-225.

[26]LEPINIEC L, DEBEAUJON I, ROUTABOUL J M, BAUDRY A,POURCEL L, NESI N, CABOCHE M. Genetics and biochemistry of seed flavonoids.Annual Review of Plant Biology, 2006, 57(1): 405-430.

[27]ZHAO J, DIXON R A. MATE transporters facilitate vacuolar uptake of epicatechin 3'-O-glucoside for proanthocyanidin biosynthesis inMedicago truncatulaandArabidopsis.The Plant Cell, 2009, 21(8):2323-2340.

[28]FRANK S, KECK M, SAGASSER M, NIEHAUS K, WEISSHAAR B, STRACKE R. Two differentially expressed MATE factor genes from apple complement theArabidopsistransparent testa12 mutant.Plant Biology, 2011, 13(1): 42-50.

[29]HE N, ZHANG C, QI X, ZHAO S, TAO Y, YANG G, LEE T H,WANG X, CAI Q, LI D, LU M, LIAO S, LUO G, HE R, TAN X, XU Y, LI T, ZHAO A, JIA L, FU Q, ZENG Q, GAO C, MA B, LIANG J,WANG X, SHANG J, SONG P, WU H, FAN L, WANG Q, SHUAI Q,J ZHU J, WEI C, KEYAN ZS, JIN D, WANG J, LIU T, YU M, TANG C, WANG Z, DAI F, CHEN J, Y LIU Y, ZHAO S, LIN T, ZHANG S,J WANG J, WANG J, YANG H, YANG G, WANG J, PATERSON A H,XIA Q, JI D, XIANG Z. Draft genome sequence of the mulberry treeMorus notabilis.Nature Communications, 2013, 4(9): 2445-2454.

[30]PéREZDíAZ R, RYNGAJLLO M, PéREZDíAZ J, PE?A-CORTéS H, CASARETTO J A, GONZáLEZ-VILLANUEVA E, RUIZ-LARA S. VvMATE1 and VvMATE2 encode putative proanthocyanidin transporters expressed during berry development inVitis viniferaL.Plant Cell Reports, 2014, 33(7): 1147-1159.

[31]ZIELI?SKA D, TUREMKO M, KWIATKOWSKI J, ZIELI?SKI H.Evaluation of flavonoid contents and antioxidant capacity of the aerial parts of common and tartary buckwheat plants.Molecules, 2012, 17(8):9668-9682.

[32]ZHENG S J, MA J F, MATSUMOTO H. Continuous secretion of organic acids is related to aluminium resistance during relatively long-term exposure to aluminium stress.Physiologia Plantarum,2010, 103(2): 209-214.

[33]MA J F, RYAN P R, DELHAIZE E. Aluminium tolerance in plants and the complexing role of organic acids.Trends in Plant Science,2001, 6(6): 273-278.

[34]MA J. Detoxifying aluminum with buckwheat.Nature, 1997,390(6660): 569-570.