三種培養基對人臍帶間充質干細胞培養生長和數量影響的比較

高健偉，郭紅燕，李艷生

人臍帶間充質干細胞在實驗及臨床有廣泛的應用，取得了很多很好的成果，逐漸成為人們研究的熱點；但干細胞的培養擴增還存在較多問題，很多因素都可能導致原代干細胞體外培養失敗（如選擇培養基、血清、臍帶質量、無菌情況、技術操作等），即使成功培養間充質干細胞 （mesenchymal stem cells，MSCs），其生長狀態不良、數量少、細胞收集不足等情況，影響實驗結果。筆者對目前使用的三種不同培養基進行原代干細胞培養，對其觀察細胞培養數量的結果具體分析如下。

1 材料與方法

1.1 培養基、試劑和儀器 低糖DMEM、高糖DMEM、DMEM/F12（均使用 HyClone），青霉素和鏈霉素 100×（Solabio），15%FBS（Gibco），培養皿（美國康寧），倒置顯微鏡 （100×），熒光倒置顯微鏡（100×）。

1.2 不同培養基的培養皿孔數計數 全部采用同一廠家6孔培養板，同一培養板只能用一種培養基，共3板，1孔為一份標本，共18份標本。

1.3 培養時間和觀察內容 不同培養時間點，分別是 7、10、15、20、25 d， 在不同時間點觀察不同培養基對細胞游出面積、細胞計數的影響。

1.4 臍帶采集和培養 人臍帶間充質干細胞原代培養采用組織塊貼壁法進行，同一嬰兒的臍帶進行三種不同培養基培養。足月、健康剖腹產產婦的新鮮、無菌、健康的新生兒臍帶長約24 cm，用4℃無菌恒溫盒儲存運輸，即刻消毒，用PBS（含1∶1000的青霉素和鏈霉素）反復沖洗表面血跡和血管內殘留血液，清洗徹底干凈，隨后用組織剪剪取干凈、清亮、飽滿部分的臍帶，每一段長約1 cm，挑選取用18段用PBS再次反復沖洗。沖洗干凈后用血管鉗和眼科剪細心分離先將臍帶靜脈和動脈去除，然后去除羊膜，剩余即為華通膠。取無菌一次性培養皿用眼科剪將華通膠一般剪成1 mm×1 mm×1 mm組織塊，平均分別種在一次性無菌6孔板的培養板底部，隨后把培養板放在37℃，5%CO2恒溫孵育箱中1.5～2.5 h。1.5～2.5 h后取出在超凈操作臺上用加液器緩慢小心分別加入DMEM低糖、DMEM高糖、DMEM/F12培養液（含1∶100的青霉素和鏈霉素）。倒置顯微鏡下觀察未見異常后置于37℃，5%CO2恒溫孵育箱內培養，孵育期間要更換培養基。

2 結果

2.1 細胞游出面積和細胞計數情況 在相同的培養條件下，采用足月、健康剖腹產產婦的新鮮、無菌、健康的新生兒臍帶。以每厘米臍帶培養進行比較計數，三種不同培養基細胞游出概率及細胞計數比較見表 1、2。

2.2 人臍帶MSCs形態學特性 人臍帶華通膠行組織塊貼壁法培養間充質干細胞，分別應用A組、B組、C組進行培養。觀察7 d、15 d細胞發現：A組B組細胞游出時間偏長，數量較少，成功概率下降，鏡檢發現干細胞游出少，瘦小，生長緩慢，呈索狀偏長，細胞排列稀疏；C組細胞游出時間較短，數量較多，大片呈集落群體生長，生長迅速，增殖較快，成功概率較高，鏡檢發現干細胞游出較多，體積較大，呈條索狀或菱形偏長，形態均一，大多數平行生長，細胞融合及細胞排列緊密，多數可出現多層細胞，細胞生長旺盛［1，2］。

表1 不同培養基細胞不同時點游出面積百分比（%）

表2 不同培養基不同時點細胞計數（每厘米臍帶）

2.3 不同培養基及不同時間段對原代細胞培養的影響 通過三種不同培養基進行原代干細胞培養發現：在三種培養基中C組培養為最佳；B組次之，A組一般。

采用SPSS 13.0統計軟件進行重復測量方差分析，結果顯示，三種不同培養基及不同時間段比較，P＜0.05，差異具有統計學意義。結果還顯示，P值（Sig）均＜0.05。

認為DMEM低糖和DMEM高糖、DMEM高糖和DMEM/F12、DMEM/F12和DMEM低糖三組之間對比對細胞生長差別有統計學意義。

3 討論

人臍帶間充質干細胞 （human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUC－MSCs）起源于成體干細胞的中胚層，來源于臍帶的華爾通膠或叫沃頓膠（whartoncs jelly，WJ），是具有自我更新和多向分化的多能干細胞，參與神經的修復，促進多種有利因子的產生，在其組織內可以進行遷移、整合、調節、分泌等作用，在脊髓損傷的修復治療方面較其他干細胞治療更具有明顯優勢［3－11］，成為目前干細胞研究的焦點和熱點。

臍帶處理要求清洗干凈，必須選擇足月剖腹產健康胎兒的新鮮臍帶，低溫保存4 h內處理，時間越短越好，最好不要超過24 h；李鐸等［12］對臍帶進行24 h內處理，HUC－MSCs獲得量及分離成功率高，隨時間延長獲得量減少，分離成功率降低。竇慧慧［13］應用MesencultTM培養基對原代細胞進行培養發現細胞培養成功率達到100%；但其價格較高，適于專業干細胞技術人員。

人臍帶間充質干細胞原代培養對培養基的選擇十分重要［14－16］，對今后培養成功起著關鍵決定性作用；一般科研院校學生應用DMEM/F12培養基已足夠，價格低，經濟實惠；應用MesencultTM培養基價格太高。FBS濃度一般控制在10%～20%，該研究經過多次濃度配比比較發現采用15%的培養基效果較好。個別干細胞需要更高濃度的培養基。A組加15%FBS加1%青鏈霉素雙抗，行人臍帶華通膠原代培養時間一般情況下比同期干細胞培養延長3天，細胞生長緩慢，貼壁率低；B組加15%FBS加1%青鏈霉素雙抗，行人臍帶華通膠原代培養一般情況下最早開始5 d就可見干細胞貼壁生長，10 d左右干細胞自組織塊游離出來越來越多，14 d開始貼壁生長逐漸旺盛，22 d左右細胞生長開始逐漸變得緩慢；C組加15%FBS加1%青鏈霉素雙抗，3 d就可見少量干細胞貼壁生長，5 d可見明顯生長，7 d左右干細胞自組織塊游離出來越來越多，14～22 d左右貼壁生長最為旺盛，比A組B組效果明顯。一般情況下17～20 d傳代最好，25 d左右貼壁細胞生長變慢，27 d基本停止生長或老化，最長培養35 d細胞貼壁生長未再見明顯變化。

通過培養發現細胞生長形態有所不同，A組培養基培養貼壁細胞生長緩慢，排列稀疏，細胞干癟瘦小，整體體積??；B組培養的細胞生長迅速，細胞體積變大，整體體積明顯增大，后期集落群體明顯細胞密集；C組培養細胞生長形態均一，胞體飽滿，細胞狀態及密集度更高，較前兩組效果更好；同時發現臍帶 MSCs 體外增殖較快較高等多種優點［17，18］。

綜上所述，采用DMEM/F12培養基+15%FBS聯合培養所取得的原代干細胞形態均一，生長良好，質量較高，成分較純，解決了原代細胞培養生長不良，游出率較低，細胞較少，成功率較低等難題，對人臍帶間充質干細胞原代培養提供了有力依據，為提高實驗研究和培養成功率奠定了良好基礎［19］。

［1］金正帥.不同時期局部移植人臍帶間充質干細胞修復脊髓損傷的組織學觀察［J］. 中國組織工程研究，2016，20（45）：6714－6719.

［2］馬錫慧，馮凱，石炳毅.人臍帶間充質干細胞生物學特性及其研究進展［J］. 中國組織工程研究與臨床康復，2011，15（32）：6064－6067.

［3］ CHO JS，PARK SK.Transplantation of mesenchymal stem cells enhances axonal outgrowth and cell survival in an organotypic spinal cord slice culture［J］.Neurosci Left，2009，454，（1）：43－48.

［4］ ALEXANIAN AR，MAIMAN DJ，KURPAD SN，et al.In vitro and in vivo characterization of neurally modifiers and neural stem cell environment［J］.Stem Cells Dev，2008，17（6）：1123－1130.

［5］ ROONEY GE，MORAN C，MCMAHON SS，et al.Gene－modifired mesenchymal stem cells express functionally active nerve growth factor on an engineered poly lactic glycolic acid（PLGA） substrate［J］.Tissue Eng Part A，2008，14（5）：681－690.

［6］ WRIGHT，MASRI WE，OSMAN A，et al.The cell culture expansion of bone marrow stromal cells from humans with spinal cord injury：implications for future cell transplantation therapy［J］.Spinal Cord，2008，46（12）：811－817.

［7］ CAO FJ，FENG SQ.Human umbilical cord mesenchymal stem cells and the treatment of spinal cord injury［J］.Chn Med J（Engl），2009，122（2）：225－231.

［8］趙鵬，馮世慶，王穎，等.不同濃度人臍帶間充質干細胞移植修復大鼠脊髓損傷的實驗研究［J］.中國矯形外科雜志，2010，11（21）：1817－1821.

［9］魏開斌，卓鋒，劉紅，等.移植臍帶間充質干細胞治療脊髓損傷的實驗研究［J］. 中國矯形外科雜志，2012，20（22）：2081－2085.

［10］高健偉，魏開斌.人臍帶間充質干細胞治療脊髓損傷的研究進展［J］. 中國矯形外科雜志，2013，21（6）：582－586.

［11］余永濤，鐘德君.移植人臍帶間充質干細胞修復大鼠脊髓損傷的療效［J］. 生物技術世界，2016（4）：113.

［12］李鐸，石釧，洪敬欣，等.組織塊法分離人臍帶間充質干細胞的研究［J］. 中國醫藥導報，2011，8（24）：19－22.

［13］竇慧慧，郭文君，于麗，等.人臍帶間充質干細胞分離培養方法的研究［J］. 中國組織工程研究與臨床康復，2010，14（19）：186－189.

［14］韓曉燕，汪偉民.人臍帶間充質干細胞的體外培養及其對大鼠血液指標的影響［J］. 安徽醫學，2015，36（8）：911－914.

［15］王菲，周洪，郭昱成，等.原代人臍帶間充質干細胞培養方法的研究［J］. 中國組織工程研究，2014，18（19）：3042－3047.

［16］胡培，王小莉，李東升，等.人臍帶間充質干細胞的分離培養與鑒定［J］. 生物技術通訊，2014，25（1）：87－90.

［17］ FU YS，SH IH YT，CHENG TC，et al.Transformation of human umbilical mesenchymal cells into neurons in vitro［J］.J Biomde Sci，2004，5（6）：652－660.

［18］ MITCHELL KE，WEISS ML，MITCHELL BM，et al.Matrix cells from Wharton’s jelly from neurons and glia［J］.Stem Cells，2003，21（1）：50－60.

［19］李嘉，尹春艷.人臍帶間充質干細胞在臨床治療中的研究進展［J］. 醫學綜述，2016，22（10）：1931－1934.