三種培養基對人臍帶間充質干細胞培養生長和數量影響的比較

高健偉，郭紅燕，李艷生

人臍帶間充質干細胞在實驗及臨床有廣泛的應用，取得了很多很好的成果，逐漸成為人們研究的熱點；但干細胞的培養擴增還存在較多問題，很多因素都可能導致原代干細胞體外培養失?。ㄈ邕x擇培養基、血清、臍帶質量、無菌情況、技術操作等），即使成功培養間充質干細胞 （mesenchymal stem cells，MSCs），其生長狀態不良、數量少、細胞收集不足等情況，影響實驗結果。筆者對目前使用的三種不同培養基進行原代干細胞培養，對其觀察細胞培養數量的結果具體分析如下。

1 材料與方法

1.1 培養基、試劑和儀器 低糖DMEM、高糖DMEM、DMEM/F12（均使用 HyClone），青霉素和鏈霉素 100×（Solabio），15%FBS（Gibco），培養皿（美國康寧），倒置顯微鏡 （100×），熒光倒置顯微鏡（100×）。

1.2 不同培養基的培養皿孔數計數 全部采用同一廠家6孔培養板，同一培養板只能用一種培養基，共3板，1孔為一份標本，共18份標本。

1.3 培養時間和觀察內容 不同培養時間點，分別是 7、10、15、20、25 d， 在不同時間點觀察不同培養基對細胞游出面積、細胞計數的影響。

1.4 臍帶采集和培養 人臍帶間充質干細胞原代培養采用組織塊貼壁法進行，同一嬰兒的臍帶進行三種不同培養基培養。足月、健康剖腹產產婦的新鮮、無菌、健康的新生兒臍帶長約24 cm，用4℃無菌恒溫盒儲存運輸，即刻消毒，用PBS（含1∶1000的青霉素和鏈霉素）反復沖洗表面血跡和血管內殘留血液，清洗徹底干凈，隨后用組織剪剪取干凈、清亮、飽滿部分的臍帶，每一段長約1 cm，挑選取用18段用PBS再次反復沖洗。沖洗干凈后用血管鉗和眼科剪細心分離先將臍帶靜脈和動脈去除，然后去除羊膜，剩余即為華通膠。取無菌一次性培養皿用眼科剪將華通膠一般剪成1 mm×1 mm×1 mm組織塊，平均分別種在一次性無菌6孔板的培養板底部，隨后把培養板放在37℃，5%CO2恒溫孵育箱中1.5～2.5 h。1.5～2.5 h后取出在超凈操作臺上用加液器緩慢小心分別加入DMEM低糖、DMEM高糖、DMEM/F12培養液（含1∶100的青霉素和鏈霉素）。倒置顯微鏡下觀察未見異常后置于37℃，5%CO2恒溫孵育箱內培養，孵育期間要更換培養基。

2 結果

2.1 細胞游出面積和細胞計數情況 在相同的培養條件下，采用足月、健康剖腹產產婦的新鮮、無菌、健康的新生兒臍帶。以每厘米臍帶培養進行比較計數，三種不同培養基細胞游出概率及細胞計數比較見表 1、2。

2.2 人臍帶MSCs形態學特性 人臍帶華通膠行組織塊貼壁法培養間充質干細胞，分別應用A組、B組、C組進行培養。觀察7 d、15 d細胞發現：A組B組細胞游出時間偏長，數量較少，成功概率下降，鏡檢發現干細胞游出少，瘦小，生長緩慢，呈索狀偏長，細胞排列稀疏；C組細胞游出時間較短，數量較多，大片呈集落群體生長，生長迅速，增殖較快，成功概率較高，鏡檢發現干細胞游出較多，體積較大，呈條索狀或菱形偏長，形態均一，大多數平行生長，細胞融合及細胞排列緊密，多數可出現多層細胞，細胞生長旺盛［1，2］。

表1 不同培養基細胞不同時點游出面積百分比（%）

表2 不同培養基不同時點細胞計數（每厘米臍帶）

2.3 不同培養基及不同時間段對原代細胞培養的影響 通過三種不同培養基進行原代干細胞培養發現：在三種培養基中C組培養為最佳；B組次之，A組一般。

采用SPSS 13.0統計軟件進行重復測量方差分析，結果顯示，三種不同培養基及不同時間段比較，P＜0.05，差異具有統計學意義。結果還顯示，P值（Sig）均＜0.05。

認為DMEM低糖和DMEM高糖、DMEM高糖和DMEM/F12、DMEM/F12和DMEM低糖三組之間對比對細胞生長差別有統計學意義。

3 討論

人臍帶間充質干細胞 （human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUC－MSCs）起源于成體干細胞的中胚層，來源于臍帶的華爾通膠或叫沃頓膠（whartoncs jelly，WJ），是具有自我更新和多向分化的多能干細胞，參與神經的修復，促進多種有利因子的產生，在其組織內可以進行遷移、整合、調節、分泌等作用，在脊髓損傷的修復治療方面較其他干細胞治療更具有明顯優勢［3－11］，成為目前干細胞研究的焦點和熱點。

臍帶處理要求清洗干凈，必須選擇足月剖腹產健康胎兒的新鮮臍帶，低溫保存4 h內處理，時間越短越好，最好不要超過24 h；李鐸等［12］對臍帶進行24 h內處理，HUC－MSCs獲得量及分離成功率高，隨時間延長獲得量減少，分離成功率降低。竇慧慧［13］應用MesencultTM培養基對原代細胞進行培養發現細胞培養成功率達到100%；但其價格較高，適于專業干細胞技術人員。

人臍帶間充質干細胞原代培養對培養基的選擇十分重要［14－16］，對今后培養成功起著關鍵決定性作用；一般科研院校學生應用DMEM/F12培養基已足夠，價格低，經濟實惠；應用MesencultTM培養基價格太高。FBS濃度一般控制在10%～20%，該研究經過多次濃度配比比較發現采用15%的培養基效果較好。個別干細胞需要更高濃度的培養基。A組加15%FBS加1%青鏈霉素雙抗，行人臍帶華通膠原代培養時間一般情況下比同期干細胞培養延長3天，細胞生長緩慢，貼壁率低；B組加15%FBS加1%青鏈霉素雙抗，行人臍帶華通膠原代培養一般情況下最早開始5 d就可見干細胞貼壁生長，10 d左右干細胞自組織塊游離出來越來越多，14 d開始貼壁生長逐漸旺盛，22 d左右細胞生長開始逐漸變得緩慢；C組加15%FBS加1%青鏈霉素雙抗，3 d就可見少量干細胞貼壁生長，5 d可見明顯生長，7 d左右干細胞自組織塊游離出來越來越多，14～22 d左右貼壁生長最為旺盛，比A組B組效果明顯。一般情況下17～20 d傳代最好，25 d左右貼壁細胞生長變慢，27 d基本停止生長或老化，最長培養35 d細胞貼壁生長未再見明顯變化。

通過培養發現細胞生長形態有所不同，A組培養基培養貼壁細胞生長緩慢，排列稀疏，細胞干癟瘦小，整體體積?。籅組培養的細胞生長迅速，細胞體積變大，整體體積明顯增大，后期集落群體明顯細胞密集；C組培養細胞生長形態均一，胞體飽滿，細胞狀態及密集度更高，較前兩組效果更好；同時發現臍帶 MSCs 體外增殖較快較高等多種優點［17，18］。

綜上所述，采用DMEM/F12培養基+15%FBS聯合培養所取得的原代干細胞形態均一，生長良好，質量較高，成分較純，解決了原代細胞培養生長不良，游出率較低，細胞較少，成功率較低等難題，對人臍帶間充質干細胞原代培養提供了有力依據，為提高實驗研究和培養成功率奠定了良好基礎［19］。

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