牛磺熊去氧膽酸誘導牙髓干細胞的成骨分化實驗研究

陳福揚 孫艷艷 譚金娣 于易秀 劉明月 史欣 胡偉平

[摘要]目的：研究牛磺熊去氧膽酸（Tauroursodeoxycholic acid，TUDCA）對牙髓干細胞 （Dental pulp stem cells，DPSCs）增殖及成骨向分化的作用。方法：用不同質量濃度（0、10、100、30OnM）的TUDCA培養DPSCs，利用甲基噻唑基四唑（Methylthiazolylterrazolium，MTT）法計數檢測不同濃度TUDCA對細胞增殖的影響；7d后測定不同濃度TUDCA誘導后的堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）活性；倒置相差顯微鏡下觀察誘導后的DPSCs形態變化；應用茜素紅染色法檢測礦化結節的形成。結果：MTT法及ALP活性測定實驗表明，隨著TUDCA濃度的增加，ALP活性增強，細胞增殖率升高。茜素紅染色顯示TUDCA誘導培養28d后出現礦化結節。結論：TUDCA可促進DPSC增殖和成骨分化。

[關鍵詞]牙髓干細胞；牛磺熊去氧膽酸；細胞增殖；成骨分化；新型生物材料；組織工程

[中圖分類號]R329.2 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2018）03-0097-04

Taursodeoxycholic Acid Induced the Osteogentic Differentiation Ability of Dental Pulp Stem Cells

CHEN Fu-yang1，SUN Yan-yan2，TAN Jin-di1，YU Yi-xiu1，LIU Ming-yue1，SHI Xin1，HU Wei-ping1

（1.Department of Prosthodontics，the Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University，Harbin 150086，Heilongjiang，China；2.Department of Prosthodontics，Xuzhou Stomatology Hospital，Xuzhou 221000，Jiangsu，China）

Abstract： Objective To study the effect of tauroursodeoxycholic acid （TUDCA） on the proliferation and osteogenic differentiation in dental pulp stem cells （DPSCs）. Methods Methylthiazolyltetrazolium （MTT） assay was used to evaluate the proliferation rate of DPSCs induced by different concentrations of TUDCA（0，10，100，300nM）. The activity of alkaline phosphatase （ALP） after induced by different concentration of TUDCA was measured. We observed the morphologica1 changes of DPSCs by the inverted phase contrast microscope， detected the mineralize nodules stained by Alizarin red. Results The results of MTT and ALP activity measurement showed that ALP activity increased and cell proliferation rate arise with the increase of concentration of TUDCA. Alizarin red staining showed that mineralized nodules have formed after induced by TUDCA for 28 day. Conclusion TUDCA can promote the proliferation and osteogenic differentiation of DPSCs.

Key words： dental pulp stem cells； taursodeoxycholic acid； cell proliferation； osteogenic differentiation； new biomaterials； tissue engineering

組織工程再生或缺損組織修復是目前很有前途的臨床治療方法[1-2]。近年來，許多臨床醫生和研究人員一直致力于組織工程領域研究，很多研究報道用生物材料和細胞誘導組織再生：包括合成天然蛋白和生長因子[2-5]。雖然組織工程學的研究改進了臨床治療的特異性組織缺損，但是在組織工程中的廣泛應用還是受到了限制和障礙，例如功能和新生組織形態維持。在組織工程中骨修復往往缺乏血管和機械強度，很難實現復雜的骨微結構[6]。

以往研究知道，BMP系列、地塞米松具有強大的骨誘導能力。2002年以來，在骨科中一直應用BMP-2、地塞米松。然而，進一步研究和臨床應用發現，這些治療過程中需要大量昂貴的生長因子和細胞因子[7-8]，并且細胞毒性和炎癥對最后骨組織形成的成功與否都起著重要的作用，從而影響治療效果[9-10]。因此，需要發現新的藥物和因子來增強骨組織再生的成功率和術后效果。化學藥物牛磺熊去氧膽酸（Tauroursodeoxycholic acid，TUDCA）的出現和研究對這一難題帶來了解決辦法。牛磺熊去氧膽酸是一種已被美國食品和歐洲藥物管理局批準的藥物[11-12]。其具有解痙、抗驚厥、抗炎及溶膽石等作用。臨床主要用于治療膽囊膽固醇結石、原發硬化性膽管炎、原發膽汁性肝硬化和慢性丙型病毒性肝炎等[11-12]。最近報道了TUDCA顯著增加了體外骨髓間充質干細胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）的成骨化[13]。牙髓干細胞（Dental pulp stem cells，DPSCs）與骨髓間充質干細胞都具自我增殖和多種分化能力，在牙齒再生骨組織工程等方面發揮著重要作用，可以作為骨組織工程研究的理想種子細胞[14-19]。本實驗目的是研究新型生物材料牛磺熊去氧膽酸對牙髓干細胞成骨向分化的影響。

1 材料和方法

1.1 材料：胎牛血清（Hyclone，美國）；DMEM/F-12（Hyclone，美國）；牛磺熊去氧膽酸（Sigma，美國20mg）；I型膠原酶（Gibco，美國）；0.25%胰酶（上海碧云天生物技術研究所）；青霉素和鏈霉素（上海碧云天生物技術研究所）；磷酸鹽緩沖液（Phosphate-buffered saline，PBS）；茜素紅（Alizarin red S，Sigma，美國）；堿性磷酸酶試劑盒（南京建成生物工程研究所，南京）；甲基噻唑基四唑（Methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、DMSO、抗壞血酸、B-甘油磷酸鈉、L-谷氨酰胺、地塞米松（Sigma，美國）。

1.2 牙髓干細胞的分離、培養、傳代及鑒定：選擇哈爾濱醫科大學附屬第二醫院口腔外科門診采集的因正畸拔除的正常前磨牙或阻生的正常第三磨牙（患者年齡14～25歲），所有成年患者及未成年患者家屬均知情同意。依據Gronthos[15]原代細胞培養法，劈開實驗牙，用鑷子取出牙髓，含雙抗PBS充分沖洗置于體積分數為0.3%的I型膠原酶培養皿中將牙髓組織剪成約1mm×lmm×1mm的組織塊，移入離心管中在37℃的水域振蕩器中消化40min，去除上清液， 加入4ml含20%胎牛血清的培養液，l 000×g離心5min，共離心2次，去上清液，加入3ml培養液吹打混勻，最后移入培養瓶中，37℃含5% CO2的培養箱中培養，每周換液2次。電鏡下觀察到細胞呈成纖維細胞樣形態，為牙髓干細胞典型形態。待細胞覆蓋瓶底的80%左右時，0.25%胰蛋白酶消化，以1：2的比例傳代。

1.3 傳代培養DPSCs：擦拭超凈工作臺，紫外燈下照射消毒30min。倒置相差顯微鏡下觀察細胞的數量和形態，置于超凈工作臺上，倒掉培養瓶中的培養基，PBS溶液清洗3次。將胰酶消化液1～2ml置于培養瓶中，后將培養瓶置于培養箱中30s。將培養瓶自培養箱中取出，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態，當細胞由長梭形變為圓形時立即終止消化。于超凈工作臺上倒掉胰酶消化液，加入10ml含15%胎牛血清的DMEM/F-12培養液，用吸管將貼附于瓶壁的細胞吹打脫落。

1.4 DPSCs多向分化能力（成脂，成軟骨，成骨）：取第3代DPSCs細胞，分別用成骨細胞誘導的培養液為5mM β-glycerophosphate，50mg/ml vitamin-C-phosphate 和2mM L-glutamine，培養3周。用成脂肪細胞誘導的培養液為50μmol/L indomethacin，0.5μmol/L isobutylmethylxanthine和0.5μmol/L dexamethasone，培養2周。用成軟骨細胞誘導的培養液為6μg/ml Insulin，10ng/ml TGF-β1，95μmol/ml dexamethasone，37mg/ml vitamin-C-phosphate，0.8μmol/ml sodium Pyruvate，6μg/ml轉鐵蛋白。然后用油紅O染色檢測向脂肪細胞的誘導情況；甲苯胺藍染色檢測向成軟骨細胞的誘導情況；茜素紅（Alizarin Red S）染色檢測成骨細胞誘導情況。

1.5 MTT法檢測細胞增殖情況：實驗共分4組，每組設6個復孔，將第3代DPSCs以5 000個/孔接種于96孔板中，培養24h后更換為含有不同質量濃度的TUDCA（0、10、100、30OnM）培養液繼續培養，分別于培養后第l、3、5、7、9天用MTT法檢測細胞增殖情況。

1.6 堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）活性測定：將第3代DPSCs以5 000個/孔接種于96孔板中，培養24h后分別用含有不同質量濃度的TUDCA（0、10、100、30OnM）培養液繼續培養，每組6個復孔，于誘導培養的第7天棄去培養板中的培養液，在每孔中加入1% TritonX-100裂解液30μl覆蓋滿細胞，裂解30min，按說明書操作，加入基質液和緩沖液各5Oμl，充分混勻后37℃水浴15min，加入顯色劑150μl，用酶標儀測量490nm處吸光度值（A490nm），比較各組細胞ALP活性。

1.7 茜素紅礦化結節染色測定：將第3代細胞以1×105個/孔接種于6孔板中，分為4組，24h后將培養液更換為含有不同質量濃度TUDCA（0、10、100、30OnM）培養液培養。培養至28d進行茜素紅染色，PBS緩沖液沖洗3次，95%無水乙醇固定15min，蒸餾水沖洗3次，0.1%茜素紅-Tris-HC1（pH=8.3）37℃孵育30min，蒸餾水沖洗，干燥，拍照，觀察各組礦化結節形成情況。

1.8 統計學分析：應用SPSS 17.0統計軟件對結果數據進行處理，行單因素方差分析，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞培養情況：原代培養DPSCs，細胞在第4天貼培養瓶壁生長，隨后至第7天形成克隆細胞團并具有典型的成纖維細胞樣形態。培養14d后，克隆的細胞形態更統一，具有成纖維形態和長細胞突，平行排列并達到足夠數量等待傳代。傳代后，細胞增殖迅速。見圖1。

注：A.DPSCs培養第4天的形態；B.DPSCs增殖至第7天，典型的成纖維樣形態；C.細胞排列呈柵欄狀；D.DPSCs傳代后，增殖進入活躍期

圖1 DPSCs 細胞形態（40×）

2.2 DPSCs多向分化能力體外鑒定結果：細胞成脂誘導3周，成骨誘導礦化結節形成，顯示礦化成功，見圖2A；油紅O染色形成中間為空泡的脂肪細胞，見圖2B；細胞成軟骨誘導3周，甲苯胺藍染色形成藍色結節，見圖2C。

注：A.Alizarin Red S檢測成骨分化的礦化基質沉積情況；B.成脂分化顯示通過Oil Red O染色中性脂質聚集；C.甲苯胺藍染色檢測成軟骨分化情況

圖2 DPSCs多向分化能力檢測結果（40×）

2.3 細胞增殖MTT檢測結果：3組DPSCs在1～9d均呈現不同程度的生長狀態。3種不同質量濃度的TUDCA對牙髓干細胞都有促進作用，并且隨著TUDCA的濃度的升高促進增殖作用逐漸提高，特別是含300nM TUDCA組與其他組相比差異明顯，10nM TUDCA組與培養液組相比無明顯差距。見圖3。

圖3 三組DPSCs培養1～9d細胞增殖情況

2.4 ALP活性檢測結果：將第3代DPSCs誘導9d后，牛磺熊去氧膽酸對人牙髓干細胞ALP活性有促進作用，對照組、10nM、100nM、300nM TUDCA組的ALP活性分別為0.08403±0.06275、0.20808±0.0835、0.26392±0.0846、0.38267±0.1022，各實驗組與對照組比較，差異有統計學意義（P<0.05）。

2.5 礦化結節檢測結果：取克隆化第3代DPSCs培養28d，可見部分細胞發生成骨細胞樣多角形以及錐體形態改變。DPSCs在礦化誘導后逐漸產生白色點狀晶體。經茜素紅染色后光學顯微鏡下均可見橘紅色礦化結節，呈團狀或條狀不規則形態。對比后發現300nM TUDCA組可見數目多、面積較大的橘紅色礦化結節，因此證明成骨活性活性更強（見圖4）。

注：A.10nM TUDCA組；B.100nM TUDCA組；C.300nM TUDCA組

圖4 牙髓干細胞礦化誘28d后礦化結節染色結果（茜素紅染色低倍放大，40×）

3 討論

牙髓間充質干細胞是種子細胞，來源廣泛，取材方便，具有自我更新和多向分化能力，體內、體外實驗均已證實其具有很強的成骨能力。種子細胞是作為骨組織工程的關鍵因素，探尋合適的對象，優化培養條件，真正實現體外成骨，形態可塑，對治療嚴重骨缺損具有重要的意義[20-25]。從目前研究來看，雖然組織工程學的研究改進了臨床治療的特異性組織缺損，但是在組織工程中的廣泛應用還是受到限制和障礙，例如功能和新生組織形態維持。在組織工程中骨修復往往缺乏血管和機械強度，很難實現復雜的骨微結構[6]。

以往研究發現，BMP系列、地塞米松等都具有強大的誘導骨組織再生的能力，也已經在臨床得到了進一步應用和發展，但是正是在不斷的發展中，發現了各種問題，其不僅價格昂貴，還具有細胞毒性和術后炎癥反應，對于最終臨床患者的應用帶來了一定風險和不良預后。近幾年，越來越多的研究者們正在嘗試各種新型生物材料，而牛磺熊去氧膽酸的研究與進展給予了骨組織工程希望。

牛磺熊去氧膽酸作為一種治療痙攣、抗驚厥、抗炎及溶膽石等作用的藥物，隨著Byung-Hyun Cha等[13]研究發現牛磺熊去氧膽酸可以促進骨髓間充質干細胞的成骨分化，通過抑制骨髓間充質干細胞的成脂分化。骨髓間充質干細胞和牙髓間充質干細胞都是作為種子細胞，屬于多能干細胞。通過牛磺熊去氧膽酸對于體內小鼠的骨再生的研究，發現小鼠骨再生的支架生物相容性非常好，能夠增加置入組織的血管化，血管化、骨再生和骨融合是骨缺損移植修復的重要環節。這使得骨髓間充質干細胞與牛磺熊去氧膽酸之間相互作用的研究成為了熱點。

ALP是一種分泌型蛋白，他的表達是成骨細胞分化的早期指標，參與鈣化組織的形成、代謝和再生，其活性的高低可以反映不同組織、細胞的礦化能力以及向成骨方向分化的趨勢。間充質干細胞礦化的另一個經典指標是礦化結節，是一種比ALP更晚期的檢測指標。在本實驗中通過MTT檢測顯示細胞在加入TUDCA培養液的第9天已到達細胞增殖的頂峰，同時檢測了第9天ALP的活性，300nM組的ALP活性變化最顯著。根據Byung-Hyun Cha等研究[13]，為了能夠更好地取得實驗效果，本次將TUDCA的質量濃度分為（0、10、100、30OnM）4組，0nM作為對照組。MTT結果顯示TUDCA作用后的DPSCs的增殖情況和成骨分化能力的改變，表明TUDCA具有促進DPSCs增殖的能力。這與TUDCA在骨髓間充質干細胞研究結果一致。不同質量濃度TUDCA的ALP活性呈現遞增的趨勢，本次分組中300nM組活性最高，各組間比較差異具有統計學意義。隨后又繼續進行茜素紅染色實驗，得出的結論與MTT，ALP的檢測結果一致。

牛磺熊去氧膽酸對于骨髓間充質干細胞有促進成骨分化的作用。本次實驗結果顯示，TUDCA對于牙髓干細胞的成骨分化具有重要作用。對于開展口腔頜面部缺損的修復帶來一次機遇。300nM TUDCA實驗組對于牙髓干細胞的成骨分化促進效果最明顯，證實牛磺熊去氧膽酸誘導人DPSCs是一種可行、有效的促進成骨活性的方法，與之前的實驗結果一致。

牛磺熊去氧膽酸作為一種藥物，在臨床應用中才能證實其在骨再生方面的能力，應進一步實驗研究其在體內的成骨作用，并對牙髓間充質干細胞成骨分化的潛在藥物作用機制進一步研究。為了最大限度地提高骨形成和減少潛在副作用，應用動物實驗確定藥物最佳劑量，進行大型動物實驗以確定骨再生效果。

綜上，本研究表明TUDCA能促進DPSCs分化為骨組織，盡管需進一步進行體內試驗，但此研究表明了一種新型的促進成骨分化的新型生物材料，牛磺熊去氧膽酸有著廣闊的研究前景。

[參考文獻]

[1]Langer R，Vacanti JP.Tissue engineering[J].Science，1993，260：920-926.

[2]Shin H，Jo S，Mikos AG.Biomimetic materials for tissue engineering[J].

Biomaterials，2013，24（24）：4353-4364.

[3]Cha BH，Kim JH，Kang SW，et al.Cartilage tissue formation from dedifferentiated chondrocytes by codelivery of BMP-2 and SOX-9 genes encoding bicistronic vector[J]. Cell Transplant，2013，22（9）：1519-1528.

[4]Cheng Z，Teoh SH.Surface modification of ultra thin poly （epsilon-caprolactone） films using acrylic acid and collagen[J].Biomaterials，

2014，25（11）：1991-2001.

[5]Jeong SI，Kwon JH，Lim JI，et al.Mechano-active tissue engineering of vascular smooth muscle using pulsatile perfusion bioreactors and elastic PLCL scaffolds[J].Biomaterials，2005，26（12）：1405-1411.

[6]Butler DL，Goldstein SA，Guilak F.Functional tissue engineering： the role of biomechanics[J].J Biomech Eng，2000，122（6）：570-575.

[7]Liporace FA，Breitbart EA，Yoon RS，et al.The effect of locally delivered recombinant human bone morphogenetic protein-2 with hydroxyapatite/tri-calcium phosphate on the biomechanical properties of bone in diabetes-related osteoporosis[J].J Orthop Traumatol，2015，16（2）：151-159.

[8]Kang SW，Kim JS，Park KS，et al.Surface modification with fibrin/hyaluronic acid hydrogel on solid-free form-based scaffolds followed by BMP-2 loading to enhance bone regeneration[J].Bone，2011，48（2）：298-306.

[9]Bosch P，Musgrave D，Ghivizzani S，et al.The efficiency of muscle-derived cell-mediated bone formation[J].Cell Transplant，2000，9（4）：463-470.

[10]Ito C，Evans WE，McNinch L，et al.Comparative cytotoxicity of dexamethasone and prednisolone in childhood acute lymphoblastic leukemia[J].J Clin Oncol，1996，14（8）：2370-2376.

[11]Kars M，Yang L，Gregor MF，et al.Tauroursodeoxycholic acid may improve liver and muscle but not adipose tissue insulin sensitivity in obese men and women[J]. Diabetes，2010，59（8）：1899-1905.

[12]Ozcan U，Yilmaz E，Ozcan L，et al.Chemical chaperones reduce ER stress and restore glucose homeostasis in a mouse modelof type 2 diabetes[J].Science，2006，313（5790）：1137-1140.

[13]Cha BH，Jung MJ，Moon BK，et al.Administration of tauroursodeoxycholic acid enhances osteogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells and bone regeneration[J].Bone，2016，83：73-81.

[14]張智慧，胡偉平，郭陽，等.SHH和bFGF體外誘導人牙髓干細胞向神經細胞分化的研究[J].口腔醫學研究，2010，26（5）：631-635.

[15]Gronthos S，Brahim J，Li W，et a1.Stem cell properties of human dental pulp stem cells[J].J Dent Res，2002，81（8）：531-535.

[16]Nakatsuka R，Nozaki T，Uemura Y，et a1.5-Aza-2，-deoxycytidine treatment induces skeletal myogenic differentiation of mouse dental pulp stem cells[J].Arch Oral Biol，2010，55（5）：350-357.

[17]張曉艷，李小彤，曾祥龍.礦化液誘導人前磨牙牙髓干細胞向成骨細胞樣細胞的分化[J].上海口腔醫學，2010，19（4）：398-402.

[18]DAlimonte I，Nargi E，Mastrangelo F，et a1.Vascular endothelial growth factor enhances in vitro proliferation and osteogenic differentiation of human dental pulp stem cells[J].J Biol Regul Homeost Agents，2011，25（1）：57-69.

[19]Karbanova J，Soukup T，Suchanek J，et a1.Osteogenic differentiation of human dental pulp—derived stem cells under various ex-vivo culture conditions[J].Acta Medica（Hradec Kralov-e），2010，53（2）：79-84.

[20]Akintoye SO，Lam T，Shi S，et a1.Skeletal site-specific characterization of orofacial and iliac crest human bone marrow stromal cells in same individuals[J].Bone，2006，38（6）：758-768.

[21]Yang X，van den Dolder J，Walboomers XF，et a1.The odontogenic potential of STRO-1 sorted rat dental pulp stem cells in vitro[J].J Tissue Eng Regen Med，2007，1（1）：66-73.

[22]Arthur A，Rychkov G，Shi S，et a1.Adult human dental Pulp stem cells differentiate toward functionally active neurons under appropriate environmental cues[J].Stem Cells，2008，26（7）：1787-1795.

[23]Struys T，Moreels M，Martens W，et a1.Ultrastructural and immunocytochemical analysis of multilineage differentiated human dental pulp-and umbilical cord-derived mesenchymal stem cells[J].Cells Tissues Organs，2015，193（6）：366-378.

[24]Paino F，La Noce M，Tirino V，et a1.Histone Deacetylase inhibition with Valproic Acid down-regulares Osteocalcin gene ex-pression in Human Dental Pulp Stem Cells and Osteoblasts：Evi-dence for HDAC 2 involvement[J].Stem Cells，2014，32（1）：279-289.

[25]Inoue T，Sugiyama M，Hattori H，et a1.Stem cells from human exfoliated deciduous tooth-derived conditioned medium enhance recovery of focal cerebral ischemia in rats[J].Tissue Eng Part A，2013，19（1-2）：24-29.