ARMS法與測序法檢測127例非小細胞肺癌組織EGFR基因突變的結果對比分析

（1重慶醫科大學附屬第二醫院檢驗科 重慶 400000）（2第三軍醫大學大坪醫院病理科 重慶 400042）

EGFR基因位于第七號染色體短臂上（7p12），長約118 kb，由28個外顯子組成。其編碼的蛋白具有酪氨酸激酶（tyrosine kinase,TK）活性，是NSCLC最常見的驅動基因，據統計，中國NSCLC患者中EGFR突變率約為35%～40%[1]。EGFR誘導癌癥至少通過3種機制：EGFR配體的過表達、EGFR的擴增或EGFR的突變活化，其中以EGFR 的突變活化為主要機制。已經檢測到的突變數量最多的是非小細胞肺癌[2-3]。測序法是傳統廣泛應用的方法，在檢測EGFR突變中使用較多，但由于其靈敏度有限、檢測過程時間長，對技術設備條件要求嚴格等，在臨床應用受到一定限制。而ARMS法由于其靈敏度較高、耗時少、易操作等特點，在各種標本類型中甚至在外周血循環腫瘤細胞DNA中檢測EGFR突變也有一定的意義。因此本文通過ARMS法和直接測序法兩種檢測的對比，來選擇更加敏感，準確的EGFR基因檢測方法。

1.資料與方法

1.1 標本來源

對2012年7月—2013年11月在第三軍醫大學附屬大坪醫院病理科接受EGFR突變檢測的NSCLC病人標本進行研究，其中非小細胞肺癌的患者127例，其中：男性76例、女性51例、年齡26～83歲，平均年齡54.5歲。

1.2 儀器與試劑

ARMS試劑盒內含內參基因特異性引物，探針，EGFR基因突變型，內控基因特異性引物，dNTP的溶液，TaqDNA聚合酶，陽性質控品，PCR管，熒光PCR管。

1.3 檢測步驟

待測樣本進行DNA提取后，使用微量紫外分光光度計(NanoDrop1000)測定DNA濃度及純度，取10ulDNA樣本稀釋至100ng∕ul待用。將純化后的DNA用熒光PCR方法進行檢測，得到突變基因的反應曲線。測序法則上測序儀進行檢測，結果與EGFR序列進行比對。

1.4 實驗結果成功與否判定

NC1-7管的FAM信號應該無曲線升起，PC應有擴增（成典型的S型曲線），切Ct值≦28，則可繼續分析；若內參基因（IR）有擴增且19≤Ct值≤25，則可繼續分析；若Ct值較小，則可認為DNA樣品濃度過高；若其Ct值較大或無擴增，則認為DNA樣品濃度過低、發生降解，或含有PCR抑制劑。若內控基因檢測（HEX通道）有擴增且Ct≤25，則可繼續分析；若其Ct值較大或無擴增，但突變位點檢測（FAM通道）有擴增且Ct值≤38，則可繼續分析；若其Ct值較大或無擴增，而突變位點檢測（FAM通道）無擴增或有擴增但Ct值＞38，則無法繼續分析；若樣品中某基因突變位點檢測（FAM通道）有擴增且Ct值≤35，則判定該樣本突變結果陽性；若Ct值＞38或無擴增，則判定該突變結果為陰性；若35＜Ct值≤38，可重復實驗，若Ct值仍在此范圍內，則判定該樣本突變結果為疑似陽性（可能由于突變含量低造成Ct值波動）。而測序法測出的DNA序列則直接與EGFR基因序列進行比對。

1.5 統計學處理

由于是兩個率的比較，且又符合四格表資料的卡方檢驗條件（樣本含量）40，理論頻數不小于5），故采用四格表資料的卡方檢驗來比較兩個率的差別是否具有統計學意義（P＜0.05）。

2.結果

2.1 在127例兩種檢測的病人中，兩種方法均檢測到突變29例，均無突變者63例，AMRS法檢測出而測序法未測出者31例，反之4例。

表 ARMS法和測序法檢測結果四格表

根據上述四格表的分析，通過對計數資料的kappa一致性檢驗，得出兩種方法有一定的一致性（k=0.53，P＜0.05）。綜合兩種方法，最終確定有突變的患者為64例，ARMS法檢出60例，敏感性為93.75%，測序法檢出33例，敏感性為51.56%。ARMS法的檢測突變率為47.2%，而直接測序法檢測突變率為26.0%，通過四格表資料卡方檢驗對兩種方法檢出突變率的比較，ARMS法的突變檢出率要明顯高于測序法（P＜0.05）。

2.2 兩種檢測方法結果

在127例檢測標本中，ARMS共檢測到60例突變，突變率為47.2%，有34例21外顯子突變（其中32例L858R突變，2個L861Q替換）,占所有突變的56.7%，23例19外顯子缺失突變，占所有突變的38.3%，2例18外顯子G719C突變，1例20外顯子插入突變；直接測序法共檢測出33例突變，突變率為26%，其中13例21外顯子點突變，17例19外顯子缺失突變，2例20外顯子插入突變，1例18外顯子點突變。

3.討論

非小細胞肺癌（NSCLC）是一種嚴重危害人類健康的常見的惡性腫瘤，表皮生長因子受體（EGFR）的基因突變狀態是預測表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI）療效的重要指標，所以尋求一個靈敏，快速，準確的檢測EGFR基因突變方法是必要的。

測序法是指分析特定DNA片段的堿基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）與鳥嘌呤的（G）排列方式，目的是確定重組DNA的方向與結構對突變進行定位和鑒定比較研究，是檢測基因突變的金標準。PCR結果判斷標準是根據測序峰中是否出現了突變波，其高低影響結果的判斷。當突變的腫瘤細胞含量少，導致突變峰低或不能測出時，測序法就可能會出現假陰性的結果。ARMS法由于只擴增突變序列，所以靈敏度會提高，但由于只能測出包含在試劑盒里的已知突變位點，故假陰性也會發生。

測序法需特殊且昂貴設備，條件要求高，反應耗時長（每檢測一批樣本，前后總耗時超過3天），且存在著操作繁瑣，對標本所含腫瘤組織的要求比較高，敏感性不低于30%突變拷貝數。[10]判讀結果復雜，對環境和操作者有危害等諸多缺點，因而該方法僅適用于少數技術裝備精良的實驗室開展，各級醫院很少能獨立開展，使得其運用受限。而ARMS法是實時熒光定量PCR的一種，具有較高的靈敏度。趙婧雅等[11]的研究表明，對于活檢小標本而言ARMS法較直接測序法擁有更高的突變檢出率；而對于手術標本無統計學差異由檢測結果得知，最終確定有突變的患者為64例，ARMS法檢出60例，敏感性為93.75%，測序法檢出33例，敏感性為51.56%。ARMS法的檢測突變率為47.2%，而直接測序法檢測突變率為26.0%。通過四格表資料卡方檢驗對兩種方法檢出突變率的比較，ARMS法的突變檢出率要明顯高于測序法（P＜0.05）。

綜上所述，ARMS法比測序法有更高的靈敏度和突變檢出率，而且ARMS法簡單、快速，適合在臨床推廣。

[1]劉標，周曉軍.非小細胞肺癌個體化治療的靶向分子檢測[J].臨床與實驗病理學雜志，2012,28（8）；831-7.

[2]宿杰阿克蘇，候英勇，等.PCR直接測序法與ARMS檢測非小細胞肺癌EGFR基因突變[J].臨床與實驗病理學雜志，2014,30（3）：331.

[3]王向迎，劉友如，牛艷潔，等.非小細胞肺癌EGFR基因突變檢測技術進展[J].國際呼吸雜志，2012,32（10）：797.