體外模擬生精微環境誘導人臍帶來源的多能干細胞向男性生殖細胞方向分化的研究

劉思征 劉琴

（1汕頭大學醫學院第二附屬醫院兒科 廣東 汕頭 515041）（2汕頭大學醫學院第二附屬醫院婦產科 廣東 汕頭 515041）

1.前言

隨著人類生存環境的不斷變化，不育不孕癥的發病率連年升高。據統計[1]，全球大約有12～15%的育齡夫婦受到不育不孕癥的困惱，其中50%是由男性因素造成的。生殖細胞移植是治療男性不育癥的理想方法。功能生殖細胞的形成是一個復雜的過程，體外模擬合適的細胞微環境十分關鍵。人臍帶間充質干細胞（HUMSC）是一種受到疾病和環境造成基因突變可能性極低的細胞，其來源的誘導多能干細胞（HUMSC-IPS）具有類似胚胎干細胞的多向分化潛能[2]。本研究在體外模擬精原細胞生長的三維環境，提供干細胞分化所需的電、機械刺激及細胞因子，觀察HUMSC-IPS向男性生殖細胞分化的情況。

2.材料與方法

2.1 材料

2.1.1 主要試劑及設備 DMEM/F12培養基；優質胎牛血清；TRIZOL試劑；BMP4蛋白；絲裂霉素C；SYBR Premix Ex TaqTM II(Tli RnaseH Plus)；臺式高速離心機；Real-Time PCR儀；低溫與超低溫冰箱；超凈工作臺；CO2恒溫培養箱；倒置顯微鏡等。

2.1.2 標本來源 臍帶：取自汕頭大學第二附屬醫院剖宮產出生的健康足月新生兒，均征得家屬同意，放棄使用權，并經本院倫理委員會批準。HUMSC-IPS：來自本課題組前期液氮凍存細胞。

2.1.3 實驗動物 昆明小鼠：3～4周齡及新生兒小鼠，從汕頭大學醫學院動物實驗中心購買。

2.2 方法

2.2.1 小鼠睪丸支持細胞（SCs）的分離、培養及飼養層的制備出生1天昆明小鼠麻醉處死后，取出睪丸并剪碎，分離曲細精管并依次加入0.1%DNA酶、0.1%膠原酶Ⅳ、0.1%透明質酸酶，兩次消化、離心、過濾后分裝至六孔板里，加入培養基（DMEM/F12培養基+10%胎牛血清），37℃培養箱4小時后更換新鮮培養基。48小時后棄去舊培養基，PBS清洗后，加入無菌Tris-HCL低滲休克（20mmol/l，PH 7.4）2～3min，清洗后加入新鮮DMEM/F12培養基，放入培養箱，每隔2～3天換液一次。當第二代的SCs生長融合達到80%～90%時，棄去舊培養基，加入含15ug/ml絲裂霉素C的培養基孵育2h，清洗后加入0.05%胰蛋白酶/EDTA，消化、吹打、離心，將沉淀的細胞以H-DMEM培養基重懸，細胞的濃度是0.5×105/L，加入培養板里，在培養箱中保持單層貼壁培養，隔兩天換一次液，通過培養4 d使其形成單層細胞飼養層及特殊的三維立體細胞接觸表面。

2.2.2 HUMSC-IPS體外誘導自液氮中取出HUMSC-IPS凍存管，復蘇后細胞懸液轉移至飼養層皿上，輕搖培養板，使IPS克隆均勻分布于皿中，放入恒溫培養箱中培養，第二天觀察細胞貼壁情況，每日觀察克隆生長情況并更換新鮮培養基。HUMSC-IPS貼壁飼養層上后，實驗組更換為含有100ng/mlBMP4的IPS培養基，對照組更換為不含BMP4的IPS培養基，觀察細胞生長情況，以首次更換含BMP4培養基前作為D0，分別收集D3、D7、D14、D21細胞。

2.2.3 檢測SOX17和BLIMP1基因表達 將收集細胞用于RNA提取，以D0作為基礎表達量，收集第0、3、7、14及21天的總RNA，通過RT-PCR檢測生殖分化關鍵因子SOX17和BLIMP1表達量的變化。相同時間點利用兩個獨立樣本T-檢驗，組內不同時間點之間的差異利用重復測量方差分析來檢驗表達量的變化。

3.結果

3.1 小鼠睪丸支持細胞（SCs）的分離、培養 采用三種酶連續消化及低滲性處理新生昆明小鼠睪丸，SCs容易貼壁，而生殖細胞不貼壁，利用這個特性很容易分離SCs。該方法分離培養出來的SCs純度高，電鏡下觀察SCs上漂浮著一些圓形細胞即為生殖細胞，可見SCs呈單層膜狀不規則形狀。約1周后SCs鋪滿整個培養板，單個細胞胞質豐富，可見小空泡或顆粒狀物，胞核大，呈橢圓形或圓形。

3.2 HUMSC-IPS體外誘導

IPS克隆呈圓形，邊緣整齊，細胞連接緊密，如圖1。倒置顯微鏡下觀察，D0可見兩組擬胚體大小大部分相近，形態均呈現出周緣光滑，聚集緊密，為正圓形態，自發分化組較誘導組早出現形態變化，D10出現周緣毛糙、松散，克隆中央尚致密，D14大多克隆變松散；而誘導組擬胚體在誘導D14開始出現周緣毛糙、松散，持續誘導至D21克隆中央仍較致密。

3.3 HUMSC-IPS體外向生殖方向分化關鍵基因表達

RT-PCR檢測到HUMSC-IPS在體外生精微環境中培養，可以表達生殖分化關鍵基因SOX17和BLIMP1，且表達量隨誘導時間變化而不同。在添加BMP4誘導組，SOX17基因表達量在第3天升高到達最高值，隨后升高幅度減慢，在誘導14天后升高幅度明顯減慢，在21天時仍高于對照組。BLIMP1基因的表達與SOX17基因表達變化趨勢大體一致，呈規律性表達。見圖2。

圖1 IPS克隆邊緣規整，細胞間連接緊密，生長在SCs飼養層上

圖2 RT-PCR檢測到生殖分化關鍵基因SOX17和BLIMP1表達增高，且隨誘導時間變化而不同

4.討論

不育不孕癥是重要的現代社會和醫學問題，生殖細胞移植是治療不育癥的理想途徑。生殖細胞的發生是一個極其復雜的過程，其具體機制尚未完全清楚。研究表明通過類胚體形成、藥物誘導和模擬生殖細胞生長環境均可誘導干細胞往生殖方向分化。誘導多能干細胞（IPS）是具有類似胚胎干細胞（ES）多能分化潛能的一類新型細胞，目前它越來越廣泛的應用于基因治療、藥物篩選和細胞移植等領域[3]。人臍帶華爾通膠來源的間充質干細胞（HUMSC）在分化程度上較為原始，受到疾病和環境造成的基因突變可能性極低，免疫原性低，取材來源廣泛且安全無創[4]。本課題組前期已成功獲得HUMSC來源的IPS細胞，且證實了HUMSC-IPS的無限自我更新能力和多胚層分化潛能[2]，并藥物誘導其向生殖細胞方向分化做出了嘗試。

隨著研究的深入，人們發現精子的發生與睪丸微環境密切相關，在睪丸生精小管中提供微環境的唯一體細胞，是睪丸支持細胞（SCs）。SCs形成了生殖細胞發生、成長、獲能所需要的結構支持、營養、內分泌因子環境，并通過構建血睪屏障形成局部免疫赦免來保護生殖細胞，維持生殖細胞通過減數分裂并最終發育出有功能的精子[5]。本實驗通過絲裂霉素C處理純化的新生小鼠睪丸SCs后，獲得了失去分裂增值能力，但保留了細胞結構及分泌功能的SCs飼養細胞，可以為HUMSC-IPS向精原細胞分化提供立體接觸表面及內分泌因子支持，形成生殖細胞分化所需的微環境。

原始生殖細胞（PGCs）是在胚胎時期出現的最早細胞類型，具有全能細胞的特性，是精子與卵子的前體細胞，是生殖細胞發育及配子產生的基礎。SOX17和BLIMP1共同表達于PGCs中，靶向敲除SOX17后，發現多能基因及多種生殖細胞標記基因均出現表達的抑制，重新激活SOX17基因后，受抑制的相關基因表達量上升。SOX17是進入PGC階段的關鍵調節因子，而BLIMP1則抑制內胚層和其他由SOX17和BMP信號通路誘導的成體細胞基因的表達。作為SOX17的下游基因，BLIMP1敲除后同樣導致原始生殖細胞特化失敗。[6,7]因此，SOX17及其下游基因BLIMP1對早期生殖細胞特化生成及功能維持至關重要。BMP4因子屬于TGF—β家族，它通過激活SMAD家族的轉錄因子轉導其信號通路并激活一系列的下游基因來發揮作用，可誘導外胚層細胞特化發育成PGCs。[8]

BMP4因子是否通過SOX17通路的激活，從而促使生殖細胞分化形成，我們設計了上述實驗。我們通過HUMSC-IPS與SCs飼養層共培養，并添加細胞因子BMP4，體外模擬生殖細胞發生、發展需要的睪丸微環境，觀察多能細胞向生殖細胞方向分化的過程。我們觀察到，HUMSC-IPS在形態學上明顯發生了變化，周緣毛糙、松散，逐漸出現精原細胞分化跡象。通過基因層面的表達分析，我們發現SOX17基因及其下游基因BLIMP1在我們的誘導體系下，均呈規律性高表達。本實驗結果提示：（1）睪丸支持細胞構成的接觸立體微環境，可以促進多能細胞向生殖細胞分化；（2）BMP4因子通過激活SOX17通路，來促使多能細胞特化發育成PGCs，從而向生殖細胞分化方向推進。

[1]Larson, K.L., et al. Sperm chromatin structure assay parameters as predictors of failed pregnancy following assisted reproductive techniques. Hum Reprod, 2000. 15(8): p.1717-22.

[2]楊漢華，etal.，六個轉錄因子將人臍帶間充質干細胞高效重編程為誘導性多能干細胞的實驗研究[J]中華實用兒科臨床雜志，29，1331(2014).

[3]劉思征，馬廉.誘導多能干細胞的研究進展[J].汕頭大學醫學院學報，2013，(3):173-175.

[4]Ma, L.,et al.Human umbilical cord Wharton's Jellyderived mesenchymal stem cells differentiation into nervelike cells.Chin Med J (Engl),2005.118(23):p.1987-93.

[5]Xie L，et a1．Sertoli cell—mediated differentiation of male germ cell-like cells from human umbilical cord Wharton’s jelly— derived mesenchymal stem cells in an in vitro co—culture system．Eur J Med Res，2015，20：9．

[6]Irie N,et al. SOX17 is a critical specifier of human primordialgerm cell fate[J].Cell,2015,160(1):253-268.

[7]Nakaki F,et al.Induction of mouse germcell fate by transcriptionfactors in vitro[J].Nature,2013,501(7466):222-226.

[8]Li, Y.and M.M.Parast,BMP4 regulation of human trophoblast development.Int J Dev Biol,2014.58(2-4):p.239-46.