使用結扎法建立大鼠經脈不通病理模型的初步研究?

黃 琰，王燕平，張維波，賈術永，李宏彥，王 澤，葉豐瑤，王廣軍，田宇瑛

(1. 北京中醫藥大學，北京 100029； 2. 中國中醫科學院，北京 100700)

中醫基礎研究常需建立各種動物模型，其中證候模型是一個重要方面。陳小野曾對脾虛證、腎虛證等模型進行過系統研究[1-2]，并總結撰著了《實用中醫證候動物模型學》[3]?！鹅`樞·經別》指出：“夫十二經脈者，人之所以生，病之所以成，人之所以治，病之所以起”，認為經脈是疾病形成及治療的關鍵。經脈病候是中醫最早總結出來的證候模型之一，但相關的動物模型研究較少?！鹅`樞·刺節真邪》指出：“一經上實下虛而不通者，此必有橫絡盛加于大經，令之不通?！苯浢}不通是中醫病機理論中重要的發病機制，相當于現代醫學的病理學層面。研究經脈的病理作用常采用阻斷經脈的方法，即制造“經脈不通”的病理模型。1997年張維波提出了經絡的低流阻組織液通道學說，并發現了循經低流阻通道[4]，隨后又對凝膠堵塞建立的經脈不通病理模型進行了一系列研究[5-7]。現在常用的經脈阻斷方法有注射胰酶[8]、機械壓迫[9]、切斷經脈沿線脂肪帶[10]以及注射水凝膠[5]等。注射胰酶、機械壓迫均未見形成穩定的經脈不通模型，且阻斷時間有限；切斷經脈沿線脂肪帶可阻斷針刺鎮痛效應，但對其阻斷效應的延續時間尚未作進一步研究，且皮下脂肪可能隨時間推移囤積而影響阻斷效果；凝膠注射效果較好，可形成較穩定的經脈不通模型，但凝膠注射到體內后，如果時間較長，仍會有部分發生吸收和擴散，特別是下肢部活動較多的地方。因此，建立一種更穩定的經脈不通病理模型在經絡研究中尤為重要。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

清潔級雄性SD大鼠，體質量200～260 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。醫用縫合針(規格01/2 5×12)、醫用絲線(S26，No.4)，異氟烷(河北一品制藥有限公司生產)用于動物麻醉。5726F30 經絡測定儀(東華電子儀器廠)、生物流阻/組織液壓測量儀(自行研制)、配套小動物麻醉機(Matrx VMR，美國MIDMARK集團)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及前期準備 按隨機數字表法將大鼠分為結扎1組、結扎2組、結扎3組、結扎4組各12只共48只。用脫毛劑進行脫毛處理，適應性飼養2 d后進入實驗，實驗前大鼠禁食2 h。將大鼠放入麻醉機誘導盒內通入濃度為2%的異氟烷混合氧(異氟烷與氧氣的混合氣體)誘導吸入麻醉后，取出并使用面罩持續以濃度為1%～2%的異氟烷混合氧吸入維持麻醉。

1.2.2 任脈低電阻線的測量 大鼠麻醉后固定，使用5726F30經絡測定儀，銅板電極連接大鼠尾部任意一處，銅筆電極在腹部任脈區域(腹部正中線區域)的皮膚表面進行緩慢、輕柔的測量(方向與任脈垂直)；當儀表盤顯示有較大電流通過時，用紅色記號筆標記為低電阻點，測5～10個低電阻點，間距0.5～1 cm，所測低電阻點連成的平滑曲線即任脈的低電阻線，代表任脈的定位，簡稱任脈線。

1.2.3 組織液壓波的測量 圖1顯示，在腹部任脈線上選取長4～5 cm的一段作為測量區，分別將近心端和遠心端標記為A點和B點。用測量組織液波壓傳播法[11]測量任脈線的組織液壓波傳播。具體操作如下：使用生物流阻/組織液壓測量儀，將由帶側孔6號注射器針頭制作的測試針頭向心方向由B點插入大鼠任脈皮下，使側孔位于距B點1 cm處的任脈線皮下，用安固特膠將針頭固定于皮膚，該針頭用于測量組織液壓波的傳播；用2 ml注射器由與任脈垂直方向從A點旁開1 cm處插入皮下至A點，在A點注入生理鹽水形成人工丘泡。從注射器迅速注入0.1 ml的生理鹽水到任脈組織中，形成一個小丘泡，然后立刻在丘泡上施加一個50 g的砝碼，砝碼放在20 ml的注射針管內保持與皮膚垂直，施加后在丘泡部位形成壓力波，同時測量任脈線上B點的組織液壓變化，采集5.5 s的壓力數據；測試針頭連接傳感器的組織液壓信號經儀器放大后，由計算機的A/D電路采集，采集速率0.1375 s，采集后做成文件儲存。將施加砝碼前后的組織液壓平均值的差值作為組織液壓波的傳播幅度[5, 11]。

圖1 大鼠經脈結扎對組織液壓波傳導影響實驗示意圖注：EV.電磁閥；P.壓力傳感器；N1.測試針；N2.注射針；B點.測試針頭插入點；A點.皮丘注射點；a.經上結扎處；b.經外結扎處

1.2.4 經脈結扎方法 圖2顯示，結扎1組在A、B點之間選1個點，以任脈線為中心，左/右各取5 mm/5 mm作為結扎進針點和出針點；結扎2組在A、B點之間選2個點，兩點之間間隔1～2 mm，以任脈線為中心，左/右分別取4 mm/6 mm和6 mm/4 mm作為結扎進針點和出針點；結扎3組在A、B點之間選3個點，三點之間分別間隔1～2 mm，以任脈線為中心，左/右分別取4 mm/6 mm、5 mm/5 mm和6 mm/4 mm作為結扎進針點和出針點；結扎4組在A、B點之間、任脈線旁開1 cm、2 cm處各選1個點作為結扎進針點和出針點。各組進針點和出針點的連線均與任脈線方向垂直。為避免結扎時進出針拉扯對實驗造成的干擾，各組均在測量前先將結扎線按各組進出針點穿好再進行任脈線的組織液壓波傳播幅度的測量，然后再采用各組結扎方法。具體方法如下：用縫合針(規格01/2 5×12)穿過進針點皮膚，穿過其皮下肌肉，從出針點穿出，用4號絲線將所選部位皮膚與其皮下肌肉緊密結扎在一起，結扎寬度為1 cm。

圖2 大鼠結扎后的即刻解剖觀察注：箭頭為結扎處絲線

1.2.5 結扎后組織液壓波的測量與指標計算方法 各組結扎完成后，再次用同樣的方法測得結扎后任脈線的組織液壓力傳播幅度。分別計算結扎前施加壓力后和施加壓力前的液壓差的絕對值、結扎后施加壓力后和施加壓力前的液壓差的絕對值，取兩者平均值得出各組在結扎前后的壓力幅度并計算變化率，變化率計算公式為：變化率=(結扎后壓力幅度-結扎前壓力幅度)/結扎前壓力幅度。

2 結果

2.1 組織液壓波傳播的變化

表1圖3顯示，4組大鼠實驗的結果。

表1 結扎對任脈線壓力波傳播幅度的影響

注：與結扎前比較:**P<0.01

圖3 結扎前后任脈組織液壓波傳播幅度變化率

圖4顯示，在經脈外結扎，其組織液壓波傳導幅度有所增加，在任脈線上結扎其傳導幅度下降，并隨著結扎點的增多下降幅度增大，結扎3個點的下降幅度與結扎前比較差異有統計學意義。

圖4 任脈線外與線上結扎的組織液壓波變化注：(1)任脈外結扎前后壓力變化；(2)任脈線上結扎3個點前后的壓力變化；a.結扎前施加砝碼前的壓力；b.結扎前施加砝碼后的壓力；c.結扎后施加砝碼前的壓力；d.結扎后施加砝碼后的壓力

2.2 結扎8周后的組織結構變化

圖5顯示，對20只大鼠進行結扎后的長期飼養，于8周后解剖觀察發現，結扎部位皮膚與肌肉緊密黏連。

圖5 大鼠任脈結扎后8周的解剖觀察注：a.皮膚與皮下肌肉之間出現明顯黏連，箭頭為縫合線頭大鼠啃噬機化后的遺留物；b.將結扎處皮膚拉起后皮下肌肉被同時牽拉形成的條索物(箭頭所示)

3 討論

本實驗使用組織液壓波傳播法測量結扎阻斷經脈的效果。由于組織液壓波有一定的繞行能力，用一定寬度的結扎難以完全阻斷其傳導，而為了特異地阻斷某條經脈又不能結扎得太寬，故采用一定間隔的多部位結扎方法，該法也曾在坐骨神經的結扎實驗中使用[12]。表1圖3可知，在任脈線旁開的部位結扎，不能使壓力傳導減弱，反而有所增加，而在任脈線上結扎可導致壓力傳導下降，說明任脈是一條連續的、可傳導組織液壓波的組織液通道，在任脈外結扎對其傳導影響較小。由于壓力波的擴散性，在經外阻斷可導致壓力波更多地向經脈傳遞，使經上的傳導幅度增大，可解釋結扎4組的正向變化率，可能是由于操作及個體差異，導致標準差較大而未達到顯著性變化。

比較在經脈上結扎1點、2點和3點的效果發現，其壓力波下降的幅度逐漸增加，說明結扎的數量對結扎效果有明顯影響，結扎3個點之后，壓力波出現了極顯著減小(P<0.01)，產生了預期的阻斷效果，說明以1 cm結扎寬度、相隔1～2 mm結扎三處可有效阻斷經脈中組織液壓波的傳導，結扎導致組織間隙結構的改變，使組織液壓波無法傳播，與血管結扎時血管間隙變小、血流減少相類似，且可長時間保持該狀態，為建立經脈不通模型提供了重要的建模數據。

生物結構的功能研究常使用阻斷方法，觀察阻斷前后某個組織或器官的生理活動變化。經脈作為中醫理論認定的一種具有傳輸性質的生理學結構，對其功能的研究也可借鑒該方法。經脈不通本來就是經絡的一個病理狀態，如何人工可控的制造這一狀態是經絡研究的一個關鍵技術。本團隊于2009年建立了凝膠注射阻斷經脈的方法，并用組織液壓波傳播的方法證明當注射的凝膠量大于0.5 ml時，可有效阻斷經脈低流阻通道的傳導[5]，該方法可長期阻斷經脈并產生相應的病理表現，如胃經、腎經不通小型豬在大小便、體尺、牙齒尺寸等宏觀指標上表現出變化及差異[7]；胃經不通小型豬在胃腸狀態方面出現不同程度的脹氣[6]，在行為方面出現夜間活動及爬欄次數增多等煩躁不安的表現[13]；小型豬阻斷經脈后出現持續性痛閾改變[14]。但凝膠有一定流動性，解剖時發現注射的凝膠在腿部有部分擴散，一定程度上減弱了阻斷的效果。

血管結扎法已在臨床研究與動物實驗中廣泛使用，如冠脈結扎制備心肌梗死模型[15]等，而表淺部位的血管結扎對全身影響較小。而循經低流阻通道主要位于皮膚與肌肉之間的皮下疏松結締組織構成的間隙，采用一定寬度的線結扎法使該結構變窄乃至封閉后，不影響其他組織的活動，因此本實驗嘗試采用結扎法作為阻斷技術。該方法使用醫用縫合線，與組織有一定的相容度，且不易被組織吸收也不會擴散，僅導致組織間隙的減小，對其他組織如神經和血管基本無大影響。8周后的解剖觀察表明，持續的慢性結扎進一步導致結扎部位皮膚與肌肉的緊密黏連，加強了經脈不通的病理效應，與中醫臨床所見的慢性疼痛病灶點即局限性無菌性炎癥的組織黏連變化有一定的相似性[16]。

大鼠是醫學實驗最常用的動物模型，由于其皮下組織疏松、易滑動進行低流阻通道的測量有一定難度，在小型豬上使用的凝膠注射法難以移植到大鼠上，使得一些觀察如使用曠場儀的動物行為學研究難以進行，但大鼠可測量循經低電阻線。以往研究發現，小型豬的循經低流阻通道與循經低電阻線基本重合[4]，又對組織液壓波沿大鼠任脈低流阻點的傳播特性進行了研究[11]，證明其方法學的可行性。因此本實驗利用循經低電阻線代替循經低流阻通道的位置，這兩者的平均距離在小型豬上為1.5 mm[4]，小型豬和大鼠同屬于哺乳類動物，在大鼠上的距離會更小，而結扎的寬度為10 mm，故完全可以阻斷大鼠的低流阻通道。本研究首次使用結扎法在大鼠上建立經脈不通的病理模型，使得未來的經絡病理學研究可在最常用的大鼠上進行，大大擴充經絡病理學研究的范圍。

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