H2S對膿毒癥大鼠急性腎損傷保護作用及機制研究

卜克，王璐，王偉，張晶芳，劉林剛

(鄭州大學第五附屬醫院，河南 鄭州 450052)

膿毒癥作為各種因素導致的全身性炎性反應綜合癥，可累及多個系統和器官，是導致患者死亡的重要因素[1]，其中膿毒癥患者繼發急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是常見的嚴重并發癥，發生率高達40%～70%[2]，死亡率更是超過了70%[3]，嚴重威脅患者生命安全。有研究指出，若能早期發現并采取有效措施阻止膿毒癥繼發AKI患者腎功能不可逆性損傷，可減少患者死亡。硫化氫（hy-drogen sulfide，H2S）作為一種新型氣體信號分子，具有多種生物學活性，與多種疾病發生密切相關[4]，可通過抗炎、抑制氧化應激反應而減少機體損傷[5]，有研究指出[6]，H2S可通過抑制氧化應激減輕腎臟缺血再灌注損傷。本研究擬探討外源性補充H2S對膿毒癥大鼠AKI保護作用，并探討可能的機制，以期為臨床早期干預膿毒癥繼發AKI提供基礎資料。

1 資料與方法

1.1 主要儀器與試劑 凝膠電泳影像分析系統（美國 Bio－rad）；脂多糖（LPS，規格 10mg）和 NaHS（美國 Sigma 公司）；血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；白細胞介素－1β（IL－1β）、腫瘤壞死因子－α（TNF－α）檢測試劑盒（美國R&D公司）；HE染色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；TUNEL試劑盒 （美國Roche公司）；兔抗鼠Caspase－3多克隆抗體（美國CST公司）；兔抗大鼠 Bcl－2、Bax單克隆抗體 （美國 Santa Cruz公司）。

1.2 實驗動物及分組 清潔級健康雄性SD大鼠40只購自河南省實驗動物中心 （合格證號：SCXK（豫）2010－0002），6～8 周齡，體重（200±20）g，飼養于標準實驗室，自由進食、飲水。所有動物編號后，利用隨機數字表隨機分為假手術組、模型組、生理鹽水組和H2S干預組，每組10只。

1.3 大鼠膿毒癥急性腎損傷模型制備及分組處理參照文獻[7]中介紹的盲腸結扎穿孔法制備膿毒癥急性腎損傷模型。取各組大鼠，禁飲禁食10h，利用10%水合氯醛腹腔麻醉，取仰臥位固定，備皮消毒，取腹中線切口開腹，將腸系膜和盲腸充分游離后，用4號無菌絲線在回盲瓣以下進行環形結扎，使用20號針頭在盲端部進行貫通穿孔，擠出少量糞便后，放回腹腔，關腹，逐層縫合。以術后30min時出現精神萎靡、活動減少、毛發失去光澤、呼吸急促、喜飲水、解稀便作為模型成功標志。假手術組麻醉后開腹翻動腸道后即關腹。H2S干預組于造模后30min按10mg/kg劑量腹腔注射NaHS，生理鹽水組按同樣的方法給予等量生理鹽水。整個實驗過程中各組大鼠未出現死亡。

1.4 各組大鼠血清中Scr和BUN水平檢測 各組大鼠于造模12h后，采集各組大鼠股動脈血，3000r/min離心15min分離血清，利用全自動生化儀對血清中Scr和BUN水平進行檢測。

1.5 各組大鼠腎臟組織病理學觀察 各組大鼠于造模12h后，處死，將雙側腎臟摘除，將右腎快速保存于－70℃液氮中，取部分左腎組織，4%多聚甲醛固定后，梯度酒精脫水，石蠟包埋后，切片，HE染色，利用光學顯微鏡進行觀察。

1.6 各組大鼠血清和腎臟組織中 MDA、SOD、IL－1β、TNF－α水平檢測 采集各組大鼠股動脈血，3000r/min離心15min分離血清，取部分右腎組織，用預冷生理鹽水制備組織勻漿，4℃下于3500r/min離心20min，留取上清液。采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法分別檢測血清和腎臟組織中MDA、SOD、IL－1β、TNF－α 水平，所有操作均在標準實驗條件下，按試劑盒說明完成操作。

1.7 TUNEL法檢測各組大鼠腎臟組織中細胞凋亡取各組大鼠腎臟組織石蠟標本，切片后，脫蠟水化，利用檸檬酸鈉緩沖液微波120s進行抗原修復，3%雙氧水處理4min，用PBS清洗 3次，加入TUNEL試劑，于37℃下孵育90min，加入3%甲醛－H2O2溶液阻斷 15min，加入 POD 轉換液 50μl，37℃孵育25min，用PBS清洗3次，DAB顯色6min，蘇木素復染，制片后用光學顯微鏡進行觀察，拍照，隨機取10個高倍視野計數陽性細胞數，計算細胞凋亡率=（陽性細胞數/細胞總數）×100%。

1.8 Western blot法檢測各組大鼠腎臟組織中Caspase－3、Bcl－2、Bax 蛋白表達 取部分右腎組織，剪碎后研磨，加入細胞裂解液裂解，提取總蛋白，用BCA總蛋白檢測試劑盒檢測蛋白純度并定量。取30μg總蛋白，進行SDS－PAGE電泳，電轉移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫下封閉120min，分別將一抗兔抗鼠Caspase－3多克隆抗體、兔抗大鼠Bcl－2、Bax 單克隆抗體加入（稀釋比例：1：1200、1：800、1：1000），4℃下過夜孵育，用 TBST 沖洗 3 次，加入二抗，室溫下孵育120min，用TBST沖洗3次，加入ECL化學發光試劑避光反應20min，拍照，利用Image J圖像分析軟件對各組大鼠腎臟組織中Caspase－3、Bcl－2、Bax 蛋白相對表達量進行分析。

1.9 統計學分析 采用SPSS 21.0統計分析軟件完成數據整理分析，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用 LSD－t檢驗，P＜0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血清中Scr和BUN水平 與假手術組相比，模型組、生理鹽水組和H2S干預組大鼠血清中Scr和BUN水平均升高，差異均有統計學意義（P＜0.05），與模型組和生理鹽水組相比，H2S 干預組大鼠血清中Scr和BUN水平均降低，差異均有統計學意義（P＜0.05），詳見表 1。

表1 各組大鼠血清中Scr和BUN水平比較（n=10，±s）

表1 各組大鼠血清中Scr和BUN水平比較（n=10，±s）

注：與假手術組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與生理鹽水組相比，cP＜0.05。

BUN（mmol/L）5.97±0.37 30.15±4.28a 29.13±4.17a 17.29±4.98abc 74.086 0.000組別假手術組模型組生理鹽水組H2S干預組F P Scr（μmol/L）39.54±5.83 128.65±12.37a 131.28±13.16a 78.32±9.14abc 172.066 0.000

2.2 各組大鼠腎臟組織病理學變化 HE染色結果顯示，假手術組大鼠腎臟組織中細胞排列規則、結構完整，胞核居中、核仁清楚，細胞質染色均勻，未發生變性、壞死，腎小球形態未發生改變；模型組和生理鹽水組大鼠腎臟組織中腎小管上皮細胞出現腫脹、水樣變性、空泡變性，腎小管出現擴張、其間可見脫落細胞，腎間質出現充血水腫，出現腎小球炎表現；與模型組和生理鹽水組相比，H2S干預組大鼠腎臟組織損傷減輕，細胞異常減少，間質充血水腫減輕，詳見圖1。

2.3 各組大鼠血清和腎臟組織中 MDA、SOD、IL－1β、TNF－α水平 與假手術組相比，模型組、生理鹽水組和H2S干預組大鼠血清和腎臟組織中MDA、IL－1β和TNF－α水平均升高，而SOD水平降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與模型組和生理鹽水組相比，H2S干預組大鼠血清和腎臟組織中MDA、IL－1β和TNF－α水平均降低，而SOD水平升高，差異均有統計學意義（P＜0.05），詳見表 2。

圖1 各組大鼠腎臟組織病理學變化（A：假手術組；B：模型組；C：生理鹽水組；D：H2S 干預組，HE×400）

2.4 各組大鼠腎臟組織中細胞凋亡情況 假手術組大鼠腎臟組織中偶見凋亡的腎小管上皮細胞，細胞凋亡率（5.2±1.4）%，與假手術組相比，模型組、生理鹽水組和H2S干預組細胞凋亡率均升高，分別為（21.6±4.8）%、（22.8±5.6）%和（11.5±2.7）%，差異有統計學意義（F=60.374，P=0.000），與模型組和生理鹽水組相比，H2S干預組細胞凋亡率降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.5 各組大鼠腎臟組織中 Caspase－3、Bcl－2、Bax蛋白表達 與假手術組相比，模型組、生理鹽水組和H2S干預組大鼠腎臟組織中Caspase－3、Bax蛋白相對表達量均升高，而Bcl－2蛋白相對表達量降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與模型組和生理鹽水組相比，H2S干預組大鼠腎臟組織中Caspase－3、Bax蛋白相對表達量均降低，而 Bcl－2 蛋白相對表達量升高，差異均有統計學意義（P＜0.05），詳見表3和圖2。

3 討論

膿毒癥作為重癥監護室患者首要的致死性疾病，發病率較高且呈逐年上升趨勢[8]，嚴重威脅人類生命健康。目前，膿毒癥發生機制尚未完全清楚，且發病過程中可導致多器官損傷，其中，AKI是常見的并發癥，且病情危重，臨床治療效果不佳，具有較高的致死率[9]。H2S作為繼NO、CO后又一種新型氣體信號分子，已被發現在機體多個系統中發揮重要生理調節作用[10]，在抗炎、抗氧化應激反應中發揮重要作用，對抗細胞凋亡、保護重要器官具有重要意義[11]。張穎等[12]指出，H2S作為一種內源性介質可通過作用于線粒體調節能量代謝而減輕截止創傷導致的大鼠腎結構和功能損害。許武軍等[13]等指出，內源性H2S通過抑制NF－κB表達而減輕尿源性膿毒血癥腎損傷。本研究利用經尾靜脈注射LPS的方法建立大鼠膿毒癥模型，HE染色結果顯示，模型組大鼠腎臟組織中腎小管上皮細胞出現腫脹、水樣變性、空泡變性，腎小管出現擴張、其間可見脫落細胞，腎間質出現充血水腫，出現腎小球炎表現，同時，模型組大鼠血清中Scr和BUN水平均升高，說明膿毒癥大鼠發生了AKI，模型構建成功。

表2 各組大鼠血清和腎臟組織中MDA、SOD、IL-1β、TNF-α水平比較（n=10，±s）

表2 各組大鼠血清和腎臟組織中MDA、SOD、IL-1β、TNF-α水平比較（n=10，±s）

組別 血清M D A（n m o l/L）假手術組模型組生理鹽水組H 2 S干預組F P 5.0 8±0.7 5 1 2.8 5±1.1 7 1 3.0 6±1.2 1 8.9 5±0.8 2 1 4 8.6 4 1 0.0 0 0腎臟組織3.7 2±0.8 1 7.3 2±0.9 9 7.2 7±0.8 5 5.9 1±0.9 6 2 5.0 1 8 0.0 0 0 S O D（U/m L）I L－1 β（n g/L）血清 腎臟組織 血清 腎臟組織 血清 腎臟組織1 6 6.7 2±1 2.0 7 1 0 9.6 5±1 1.8 6 1 1 1.3 4±1 2.0 5 1 3 2.8 6±1 1.4 3 5 0.3 4 4 0.0 0 0 T N F－α（n g/L）M D A（n m o l/L）8 4.1 7±1 3.9 8 4 0.3 8±1 1.6 4 3 9.2 7±1 0.5 9 6 0.2 6±9.6 2 4 4.2 9 0 0.0 0 0 4 8.2 4±5.6 8 1 0 8.3 5±1 0.5 7 1 1 2.5 2±1 2.8 6 7 3.2 8±8.9 7 1 0 5.7 8 3 0.0 0 0 7 8.9 5±1 0.2 8 3 6 8.2 5±1 6.1 7 3 5 9.9 2±1 3.9 4 1 0 2.3 6±9.5 3 1 8 6 1.3 8 6 0.0 0 0 6 7.2 8±4.0 9 9 5.1 5±5.3 7 9 8.2 6±5.7 2 8 0.3 1±4.4 2 6 6.3 5 2 0.0 0 0 1 0 8.3 6±6.1 7 1 5 2.2 7±7.9 8 1 5 7.1 6±8.1 8 1 2 9.3 5±6.5 2 6 9.1 6 2 0.0 0 0

表3 各組大鼠腎臟組織中Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達比較（n=10，±s）

表3 各組大鼠腎臟組織中Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達比較（n=10，±s）

注：與假手術組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與生理鹽水組相比，cP＜0.05。

0.2 6±0.0 8 0.6 2±0.1 0 a 0.6 0±0.0 7 a 0.4 3±0.1 4 abc 3 8.9 9 1 0.0 0 0組別假手術組模型組生理鹽水組H 2 S干預組F P C a s p a s e－3 蛋白0.3 4±0.1 1 0.8 0±0.1 6 a 0.7 8±0.1 3 a 0.5 1±0.1 2 abc 1 2.1 1 5 0.0 0 0 B c l－2 蛋白 B a x蛋白0.7 2±0.1 5 0.3 1±0.0 9 a 0.3 3±0.1 0 a 0.5 4±0.1 1 abc 4 9.7 2 1 0.0 0 0

圖2 各組大鼠腎臟組織中Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達

本結果顯示，與模型組和生理鹽水組相比，H2S干預組大鼠血清中Scr和BUN水平均降低，HE染色結果顯示，H2S干預組大鼠腎臟組織損傷減輕，細胞異常減少，間質充血水腫減輕，說明給予H2S干預后，可有效減輕膿毒癥AKI大鼠腎組織損傷。MDA作為脂質過氧化的終產物，是反映機體組織、細胞等受氧化應激損傷嚴重程度的標志物，SOD作為一種保護性抗氧化酶，在清除自由基保護組織、器官中發揮重要作用[14]，IL－1β 和 TNF－α 作為單核巨噬細胞產生的炎癥因子，與機體炎癥反應水平密切相關，是反映機體炎癥程度的指標[15]。本研究結果顯示，與假手術組相比，模型組、生理鹽水組和H2S干預組大鼠血清和腎臟組織中MDA、IL－1β和TNF－α水平均升高，而SOD水平降低，說明膿毒癥AKI大鼠機體和腎臟組織中發生了氧化應激、炎癥反應，同時，結果顯示，與模型組和生理鹽水組相比，H2S干預組大鼠血清和腎臟組織中MDA、IL－1β和TNF－α水平均降低，而SOD水平升高，說明在給予H2S干預后，膿毒癥AKI大鼠機體和腎臟組織中氧化應激、炎癥反應水平降低，提示H2S可能通過抑制氧化應激和炎癥反應而發揮腎臟保護作用。

本結果顯示，與假手術組相比，模型組、生理鹽水組和H2S干預組細胞凋亡率均升高，與模型組和生理鹽水組相比，H2S干預組細胞凋亡率降低，說明外源性給予H2S干預后，可有效減少膿毒癥AKI大鼠腎組織中上皮細胞凋亡。Bcl－2和Bax是Bcl－2家族重要成員，Bcl－2在抑制細胞凋亡中發揮重要作用，而Bax則可促進細胞凋亡，Bcl－2/Bax平衡失調后，可導致一系列的級聯反應而最終導致執行細胞凋亡的Caspase－3分子激活，啟動凋亡程序而誘導細胞發生凋亡[16]，本研究顯示，膿毒癥AKI大鼠腎臟組織中抗凋亡蛋白Bcl－2表達下調，而促凋亡蛋白Bax表達上調，從而激活Caspase－3使細胞發生凋亡，而外源性給予H2S干預后，這一過程被逆轉，從而減少腎小管上皮細胞凋亡發生。

綜上所述，H2S可有效改善膿毒癥AKI大鼠腎功能，發揮腎臟保護作用，其機制可能與減輕氧化應激、炎癥反應，抑制凋亡相關基因活化，從而減少腎臟組織中細胞凋亡有關。

[1]Seckel MA，Ahrens T.Challenges in sepsis care：new sepsis definitions and fluid resuscitation beyond the central venous pressure[J].Crit Care Nurs Clin North Am，2016，28(4)：513－532.

[2]Olvera L，Dutra D.Early recognition and management of maternal sepsis[J].Nurs Womens Health，2016，20(2)：182－195.

[3]Han IM，Yoon CY，Shin DH，et al.Delta neutrophil index is an in-dependent predictor of mortality in septic acute kidney injury patients treated with continuous renal replacement therapy[J].BMC Nephrol，2017，18(1)：94-101.

[4]Sen N.Functional and molecular insights of hydrogen sulfide signaling and protein sulfhydration[J].J Mol Biol，2017，429(4)：543-561.

[5]Kimura H.Hydrogen sulfide and polysulfides as signaling molecules[J].Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci，2015，91(4)：131-159.

[6]Feliers D，Lee HJ，Kasinath BS.Hydrogen sulfide in renal physiology and disease[J].Antioxid Redox Signal，2016，25(13)：720-731.

[7]夏海發，孫志鵬，崔術楠，等.Protectin DX對小鼠膿毒癥致急性腎損傷的保護作用及其相關機制[J].華中科技大學學報（醫學版），2016，45(1)：39-42.

[8]Henriksen DP，Laursen CB，Jensen TG，et al.Incidence rate of community-acquired sepsis among hospitalized acute medical patients-a population-based survey[J].Crit Care Med，2015，43(1)：13-21.

[9]Dupuis C，Sonneville R，Adrie C，et al.Impact of transfusion on patients with sepsis admitted in intensive care unit：a systematic review and meta-analysis[J].Ann Intensive Care，2017，7(1)：5-12.

[10]張松，孫麗.硫化氫與糖脂代謝研究進展[J].中國循環雜志，2014，29(8)：655-657.

[11]Yang H，Wright JA，Bain RE，et al.Accuracy of the H2S test：a systematic review of the influence of bacterial density and sample volume[J].J Water Health，2013，11(2)：173-185.

[12]張穎，劉寧，任青愛，等.硫氫化鈉防治截肢術后大鼠腎臟損傷的機制[J].南方醫科大學學報，2013，33(8)：1146-1150.

[13]許武軍，陳仙，羅志剛，等.H2S對尿源性膿毒血癥腎損傷的影響[J].天津醫藥，2014，42(8)：769-773，850.

[14]Xu M，Rui D，Yan Y，et al.Oxidative damage induced by arsenic in mice or rats：A systematic review and meta-analysis[J].Biol Trace Elem Res，2017，176(1)：154-175.

[15]賈二娟.血清Hcy、hs-CRP、IL-6和TNF-α水平與急性腦梗死嚴重程度的關系[J].實驗與檢驗醫學，2017，35(3)：382-384.

[16]Guo J，Wang J，Song S，et al.Sphallerocarpus gracilis polysaccharide protects pancreatic β-cells via regulation of the bax/bcl-2，caspase-3，pdx-1 and insulin signalling pathways[J].Int J Biol Macromol，2016，93(Pt A)：829-836.