血清中IGF-1及PI3K/Akt信號通路在PCOS患者體內表達的變化及意義

李麗華

(許昌市婦幼保健院婦保科，河南 許昌 461000)

多囊卵巢綜合癥（polycystic ovarian syndrome，PCOS)是一種生育年齡婦女常見的生殖功能障礙與糖代謝異常并存的內分泌紊亂綜合癥[1]。主要臨床表現為月經周期不規律、不孕、多毛或痤瘡，是最常見的女性內分泌疾病。目前PCOS的發病機制尚未明確，近年來發現PCOS患者存在不同程度的胰島素抵抗（insulin resistance，IR），胰島素抵抗會引起高胰島素血癥，從而導致子宮內膜的異常增生甚至癌變[2]。體外試驗證實，胰島素可促進子宮內膜癌細胞增殖，加速癌細胞進展[3]。研究表明，卵巢胰島素抵抗的本質是胰島素樣生長因子(insulin－like growth factor，IGF) 分裂信號的級聯放大及組織反應性升高，導致胰島素受體底物（IRS）表達異常[4]，IRS通過激活P13K/AKT通路促進細胞增殖和合成代謝。P13K/AKT通路是參與體內糖脂代謝的重要病理生理機制，激活的胰島素受體能夠通過聚集并磷酸化各種底物蛋白（IRS）而激活細胞內的P13K/AKT通路。本研究通過檢測多囊卵巢綜合征（PCOS）患者IGF-1、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）、蛋白激酶 B（Akt）的表達及意義，旨在為PCOS的診治提供臨床依據，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年2月至2017年2月在河南省許昌市婦幼保健院治療的PCOS患者100例，其中不存在胰島素抵抗（IR）患者57例（A組），存在IR患者43例（B組），納入標準：⑴診斷符合2003年歐洲人類生殖和胚胎學會和美國生殖醫學會制定的標準[4]；⑵患者及家屬知情同意并簽署同意書。排除標準：⑴近3個月使用過激素類藥物；⑵合并有甲狀腺功能異常、腎上腺疾病等其他內分泌疾病。同時選取非PCOS患者60例作為對照組 （因輸卵管因素不孕經前或卵巢良性腫瘤術前行診刮術者）。

1.2 實驗方法

1.2.1 胰島素抵抗指數（HOMA-IR）、IGF-1含量測定 患者過夜禁食10h后，在次日清晨8時抽取靜脈血2ml，3500r/min離心15min，分離上層血清置于-20℃冰箱待測。使用葡萄糖氧化酶法測定患者空腹血糖（FBG）水平，使用ELISA法測定空腹胰島素(fasting insulin，FINS)水平并計算 HOMA-IR，計 算 公 式 ：HOMA-IR=FINS×（FBG/22.5）。 使 用ELISA方法測定人血清IGF-1含量，試劑盒購自Sigma-aldrich公司。所有操作步驟均按試劑盒說明書進行。

1.2.2 標本采集和PI3K-Akt通路表達檢測 患者在月經來潮后的12h以內采集子宮前后壁的新鮮內膜組織，取得組織存放于無菌凍存管后移至-80℃冰箱保存待用，行Western Blotting檢測。

Western Blotting檢測主要步驟：冰浴條件下使用細胞裂解液提取子宮內膜的總蛋白，BCA方法測定總蛋白的濃度，自動酶標儀讀取數據。制備分離膠，濃度為10%。上樣取既定樣品蛋白質50μg。積層膠所加電壓為80V，SDS-PAGE采用10%分離膠恒壓120V分離目的蛋白；恒流300mA轉膜1h；含5%脫脂奶粉的TBST溶液4℃封閉過夜；孵育一抗，1×TBST室溫下洗膜三次，一抗稀釋比例為1：1000（Akt、p-Akt兔源單克隆抗體購自美國CST公司），4℃搖床過夜；孵育二抗，1×TBST室溫下洗膜三次，二抗稀釋比例為1：5000，搖床室溫下孵育1h（HRP標記的羊抗兔IgG，美國Zymed Laboratories）。使用增強化學發光(ECL)試劑盒發光顯影。膠片經凝膠成像系統掃描成像、分析，以各指標與內參照的比值表示其相對表達水平。兔抗人PI3K﹑內參照為β肌動蛋白(β-actin)兔源多克隆抗體，均購自美國Abcam公司。所有操作按照說明書進行操作。

1.3 統計學處理 統計分析采用SPSS 19.0軟件，計量資料采用（±s）表示，組間比較使用方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。相關分析采用Pearson分析。以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 三組年齡、血清IGF-1水平比較 三組受試者年齡比較差異無統計學意義（P＞0.05）；A組和B組患者 IGF-1、HOMA-IR、FBG和 FINS明顯高于對照組 （P＜0.05）；B 組患者 IGF-1、HOMA-IR、FBG和FINS明顯高于A組（P＜0.05）。見表1。

2.2 三組子宮內膜PI3K、Akt及p-Akt表達比較A組和B組患者子宮內膜PI3K、Akt和p-Akt明顯高于對照組（P＜0.05）；B組患者子宮內膜PI3K、Akt和 p-Akt明顯高于 A 組 （P＜0.05）。 見圖 1，表2。

2.3 相關性分析 將 PCOS患者 IGF-1、PI3K、Akt和p-Akt表達量與HOMA-IR進行Pearson相關分析， 結果顯示：PCOS患者 IGF-1、PI3K、Akt和 p-Akt表達量與 HOMA－IR 呈正相關（r=0.321、0.336、0.401 和 0.366，P＜0.05）。見表 3。

表1 三組年齡、血清IGF-1、HOMA-IR、FBG及FINS水平比較（±s）

表1 三組年齡、血清IGF-1、HOMA-IR、FBG及FINS水平比較（±s）

注：a表示與對照組比較P＜0.05；b表示與A組比較P＜0.05。

組別 例數A組B組對照組57 43 60 F P年齡（歲） IGF-1（ng/ml） FBG（mmol/L） FINS(mU/L) HOMA-IR 30.01±4.38 29.64±3.20 30.12±5.22 2.044 0.103 432.28±87.39a 489.01±90.44ab 281.04±75.29 64.291＜0.001 6.14±1.43a 7.55±1.50ab 5.41±0.89 23.104＜0.001 7.35±1.16a 12.60±1.26ab 4.99±0.94 30.573＜0.001 2.04±0.84a 3.91±0.91ab 1.20±0.74 42.011＜0.001

表2 三組血清PI3K、AKT及p-Akt表達量比較（±s）

表2 三組血清PI3K、AKT及p-Akt表達量比較（±s）

注：a 表示與對照組比較P＜0.05；b 表示與 A 組比較P＜0.05。

0.7 1 3±0.1 2 3 a 1.1 0 1±0.1 1 2 ab 0.4 0 6±0.1 0 3 2 0.0 6 3＜0.0 0 1組別A組B組對照組例數4 3 5 7 6 0 F P P I 3 K表達量 A k t表達量 p－A k t表達量0.8 9 1±0.1 1 2 a 1.1 0 2±0.1 8 1 ab 0.5 4 1±0.1 0 4 2 2.0 3 3＜0.0 0 1 0.8 1 2±0.1 2 0 a 1.2 0 4±0.2 4 ab 0.4 2 2±0.1 0 1 2 5.2 8 1＜0.0 0 1

圖1 Western blot檢測圖

表3 IGF-1、PI3K、Akt和p-Akt表達量與HOMA-IR相關分析結果

3 討論

多囊卵巢綜合癥（polycystic ovarian syndrome，PCOS)是一種生殖功能障礙與糖代謝異常并存的內分泌紊亂綜合癥，是生育期婦女月經紊亂最常見的病因[5]。POCS的發病機制尚不明確，其病理生理過程涉及了機體包括糖代謝、脂肪代謝、蛋白質代謝等多種代謝途徑異常[6]。其中糖代謝異常主要表現為胰島素抵抗，導致PCOS患者代償性高胰島素血癥。Arduc等[7]研究發現，PCOS患者普遍存在不同程度的IR，同時當IR伴有高胰島素血癥時，會大大增加子宮內膜增生甚至癌變的幾率。本研究結果顯示，PCOS患者HOMA－IR明顯高于正常人（P＜0.05），同時存在 IR 的 PCOS 患者 HOMA－IR明顯高于不存在 IR 的 PCOS 患者（P＜0.05），這與以上報道結果相符。

胰島素樣生長因子1（IGF－1）是一種在分子結構上與胰島素類似的多肽類蛋白物質[8]。IGF－1主要在肝臟中合成與表達，它可以促進機體有絲分裂，參與機體的新陳代謝等多種代謝途徑。本實驗中PCOS患者的血清IGF－1濃度高于正常人，并且存在IR的PCOS患者的血清IGF－1濃度高于不存在 IR 的 PCOS 患者（P＜0.05），提示 IGF－1 參與了PCOS的發病過程，并且與IR存在一定關系。其機制可能為，IGF－1促進卵巢雄激素的生物合成。PCOS病人因IGF－1的過度作用，引起卵泡膜聞質細胞的LH受體增加，卵巢對于黃體生成素的敏感度增加導致卵泡募集，抑制優勢卵泡的發育，促進了卵泡的閉鎖[9]。Brazert M等[10]研究發現，PCOS患者IGF－1水平明顯高于正常人。高胰島素血癥可抑制肝臟合成胰島素生長因子結合蛋白 (IGFBP－1)，游離的IGF－1增多導致機體的高胰島素環境，進一步加劇IR，促進多囊卵巢形成。陳巍等[11]發現IGF－1在PCOS大鼠模型中呈高表達，其檢測對人類PCOS的診斷及發病機制研究具有重要參考價值。這也提示可以從阻斷IGF－1的作用入手來開辟一種新的PCOS治療途徑。

PI3K/AKT通路在腫瘤和炎性反應的發生、發展過程中發揮著重要作用[12]。有研究報道，在骨肉瘤、卵巢上皮癌及腎腫瘤等多種惡性腫瘤中都發現有PI3K/Akt的過度表達[13]。由于胰島素主要通過PI3K/Akt信號通路調節代謝，而大多數PCOS患者存在IR，會導致PI3K－AKT信號通路功能失調。PCOS患者子宮內膜上皮細胞內的Akt過度磷酸化可以導致子宮內膜上皮不典型增生，He H[14]等研究發現，PI3K/AKT通路參與調節細胞增生和子宮內膜自身穩態調節。本結果發現，PCOS患者子宮內膜p－Akt表達比正常子宮內膜患者水平升高，存在IR患者子宮內膜組織中p－Akt蛋白的表達水平明顯高于不存在胰島素抵抗（IR）患者。提示胰島素P13K/Akt信號通路的過度活化，即p－Akt的過度表達參與了PCOS的發生和發展過程。通過相關性分析，PCOS患者 IGF－1、PI3K和 Akt表達量與HOMA－IR呈正相關。表明PCOS患者血清IGF－1、子宮內膜中PI3K和Akt水平明顯升高，可能與PCOS患者胰島素抵抗有一定的關系，值得進一步研究。C Palladino等[15]研究顯示，胰島素抵抗的PCOS中，PI3K/Akt信號通路過度的表達是PCOS患者子宮內膜過度增生和發生癌變的基礎。本結果中，PCOS患者的血清IGF-1濃度也高于正常人，因此分析PCOS患者PI3K/Akt的原因可能為，PCOS患者大多存在IR和高胰島素血癥，導致子宮內膜組織增生，加之高胰島素血癥的刺激，IGF與細胞膜上胰島素及胰島素樣生長因子受體結合，受到激活的受體會導致胰島素受體底物的酪氨酸殘基磷酸化，從而激活細胞內的PI3K/AKT/GSK3通路。

綜上所述，PCOS患者血清IGF-1、子宮內膜中PI3K和、Akt和 p-Akt水平明顯升高，可能與PCOS患者胰島素抵抗有一定的關系，PI3K-Akt信號通路的研究不僅能幫助了解PCOS的發病機制，同時也有望開辟治療PCOS的新途徑，值得進一步研究。

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