益腎蠲痹丸對破骨細胞-調(diào)節(jié)性T細胞共培養(yǎng)體系中破骨細胞分化及功能的影響?

郭明慧，徐慧慧，李曉亞，王 貴，黃 晶，呂 爽，路相臣，趙宏艷，肖 誠

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029； 2. 中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所，北京 100029； 3. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)，北京 100193； 4. 中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心，北京 100700)

骨骼處于不斷更新的動態(tài)平衡中，重復(fù)著骨吸收-骨形成的過程，免疫系統(tǒng)能影響骨組織的動態(tài)平衡[1]。調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory t cells，Tregs)是一類控制體內(nèi)自身免疫反應(yīng)性的T細胞亞群，與自身免疫性疾病的發(fā)生關(guān)系密切，增強Tregs細胞的活性有助于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)誘發(fā)的骨丟失[2]。破骨細胞(osteoclast，OC)在骨破壞的過程中發(fā)揮著重要的作用。有證據(jù)表明，Treg細胞可以在體外和體內(nèi)抑制OC分化，這與其通過分泌轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、白介素(IL)-10和IL-4調(diào)節(jié)破骨細胞生成有關(guān)。Tregs不僅通過細胞因子途徑發(fā)揮對OC的抑制作用，還可通過直接接觸途徑抑制破骨細胞分化及功能[3-4]，因此本課題組建立了OC-Tregs共培養(yǎng)體系[4]。益腎蠲痹丸(YSJB)是著名醫(yī)家朱良春先生的名方，可以調(diào)節(jié)RA患者的免疫功能，臨床療效顯著[5-6]。本研究通過此建立的OC-Tregs共培養(yǎng)體系，探討益腎蠲痹丸對共培養(yǎng)體系中OC分化及功能的影響。

1 材料

1.1 動物

6～8周齡雄性C57BL/6小鼠，由北京斯貝福生物技術(shù)有限公司提供，飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)附屬安貞醫(yī)院清潔級實驗動物室(實驗動物使用許可證號SCXK(京)2016-0002)。6周齡雄性SD大鼠，由中國食品藥品檢定研究所提供，飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所(實驗動物使用許可證號SCXK(京)2016-0021)。

1.2 藥品及主要試劑

YSJB由江蘇正大清江制藥公司提供；來氟米特(LEF)，蘇州長征-欣凱制藥有限公司提供。α-MEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基，美國Hyclone公司；青霉素、鏈霉素，美國Gibco公司；FBS胎牛血清，美國BioTech公司；小鼠重組核因子κв受體活化因子配基(RANKL)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、小鼠重組IL-2，美國Peprotech公司；小鼠TGF-β1，美國R&D公司；抗小鼠CD3抗體、抗小鼠CD28抗體，美國BD公司；小鼠CD4+T細胞預(yù)富集試劑盒、小鼠CD25+T細胞分選試劑盒、Blocking Solution，加拿大Stemcell公司；甲苯胺藍、抗酒石酸磷酸酶(TRAP)試劑盒，美國Sigma公司；牛骨片，英國Immunodiagnostic Systems Limited公司；小鼠IL-10 ELISA試劑盒，法國Diaclone公司；小鼠高遷移率族蛋白1(HMGB1)ELISA試劑盒，美國Chondrex公司；總RNA提取試劑盒、PrimeScriptTMRTreagent Kit試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTMⅡRT-PCR試劑盒，日本Takara公司。

1.3 主要儀器

二氧化碳細胞培養(yǎng)箱、NanoDrop 2000C超微量分光光度計，美國 Thermo Scientific 公司；PCR儀，美國 Bio-RAD公司。

2 方法

2.1 制備含藥血清

40只6周齡雄性SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為假免疫組、CIA 組、CIA+LEF組、CIA+YSJB 4組各10只，采用Ⅱ型膠原免疫制作CIA模型免疫2周后， LEF組灌服LEF(2.15 mg/kg/d)，每日1次，連續(xù)灌胃給藥3 d，YSJB組灌服YSJB(3.702 g/kg/d)，每日2次，連續(xù)灌胃給藥3 d；末次給藥1 h 后，戊巴比妥鈉麻醉，無菌條件下經(jīng)腹主動脈采血，靜置 1 h 后離心，分離血清是為含藥血清。CIA 組和假免疫組灌服等容積的蒸餾水，按以上程序分離血清，所取血清分別為 CIA 組血清和假免疫組血清。血清于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 Tregs-OC共培養(yǎng)體系的建立

2.2.1 破骨細胞前體細胞的分離與培養(yǎng) C57BL/6 小鼠脫頸處死，無菌分離股骨、脛骨，收集骨髓細胞懸液，用含20ng/ml M -CSF 的 α -MEM 培養(yǎng)液(含10% FBS、100U/ml 青霉素、100μg/ml鏈霉素)接種于培養(yǎng)瓶中。24 h后收集未貼壁細胞，以1×105個/孔加入96 孔培養(yǎng)板內(nèi)，5×105個/孔加入24孔培養(yǎng)板內(nèi)。培養(yǎng)3 d后得到破骨前體細胞。

2.2.2 CD4+CD25+Tregs的誘導(dǎo)激活 C57BL/6 小鼠脫頸處死，無菌分離脾臟制備脾細胞懸液，將細胞濃度調(diào)整至1×108個/ml，用小鼠CD4+T細胞預(yù)富集、小鼠CD25+T細胞分選試劑盒及磁珠分選器進行分選，用分化培養(yǎng)液(RPMI-1640培養(yǎng)基+2 μg/ml抗小鼠CD28+1000 U/ml IL-2+10 ng/ml TGF-β+10%FBS+100 U/ml 青霉素、100 μg/ml鏈霉素)重懸細胞，接種于用抗小鼠CD3(10 μg/ml，50 μl/孔)包被過的圓底96孔板內(nèi)，此為誘導(dǎo)成功的Tregs，陽選的CD4+CD25+Tregs用于進行后續(xù)實驗。此為本課題前期摸索的實驗方法，經(jīng)流式細胞術(shù)鑒定Tregs表型[4]。

2.2.3 OC-Tregs共培養(yǎng)體系的建立 按前期方法[4]，將M-CSF預(yù)誘導(dǎo)3 d后的破骨前體細胞與誘導(dǎo)激活后陽選的Tregs以1∶25比例加入96孔/24孔板內(nèi)，建立共培養(yǎng)體系，所采用的培養(yǎng)液為OC分化培養(yǎng)基(20 ng/mlM-CSF、100ng/mlRANKL、10%FBS、100 U/ml 青霉素、100 μg/ml鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基)。

2.3 共培養(yǎng)體系中破骨細胞分化及骨吸收功能的檢測

按上述方法，將M-CSF預(yù)誘導(dǎo)3 d后的破骨前體細胞與誘導(dǎo)激活后陽選的Tregs以1∶25的比例加入96孔板內(nèi)(孔板內(nèi)預(yù)置蓋玻片或牛骨片)，第3天加入10%含藥血清，分別是假免疫組血清(OC+Tregs+Control組)、CIA模型組血清(OC+Tregs+CIA組)、CIA+LEF組血清(OC+Tregs+LEF組)、CIA+YSJB組血清(OC+Tregs+YSJB組)，隔日半量換液，保持含藥血清濃度不變。培養(yǎng)第6天，TRAP染色后倒置相差顯微鏡下計數(shù)96孔板內(nèi)TRAP染色陽性的OC(細胞核≥3)數(shù)目；培養(yǎng)至第12天，取出牛骨片進行甲苯胺藍染色，顯微鏡下觀察骨吸收陷窩形態(tài)，用Leica Qwin圖像分析系統(tǒng)分析骨吸收陷窩面積。

2.4 共培養(yǎng)體系上清中IL-10和HMGB1含量的檢測

培養(yǎng)至第6天取各組的培養(yǎng)上清，采用ELISA法測定細胞上清中IL-10和HMGB1的含量。

2.5 共培養(yǎng)體系中HMGB1、晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)和IL-10基因表達的檢測

表1顯示，培養(yǎng)至第6天，采用Real-time PCR法檢測Tregs中的IL-10mRNA和OC內(nèi)的HMGB1、RAGE mRNA表達水平。各組細胞按Takara RNA 提取試劑盒說明書提取總RNA，并測定總RNA純度和濃度，根據(jù)總RNA用PrimeScriptTMRTreagent Kit試劑盒合成cDNA。引物根據(jù)基因庫同源基因序列進行設(shè)計，由上海生工合成。Real-time PCR 步驟按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡRT-PCR試劑盒說明書進行，擴增條件為95 ℃變性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，擴增45個循環(huán)，實驗數(shù)據(jù)由PCR檢測儀收集，按照2-△△ct相對定量公式計算各組目的基因表達量。

表1 引物序列

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 益腎蠲痹丸對OC-Tregs共培養(yǎng)體系中破骨細胞分化及骨吸收功能的影響

表2圖1顯示，與OC+Tregs+Control組比較，OC+Tregs+CIA組、OC+Tregs+LEF組、OC+Tregs+YSJB組OC數(shù)目及骨吸收陷窩面積明顯增加(P<0.01，P<0.05)；與OC+Tregs+CIA組比較，OC+Tregs+LEF組和OC+Tregs+YSJB組OC分化數(shù)目和骨吸收陷窩面積顯著減少(P<0.01)。

表2 OC-Tregs共培養(yǎng)體系內(nèi)OC數(shù)量和骨陷窩吸收面積的變化

注：與OC+Tregs+Control組比較：*P<0.05，**P<0.01；與OC+Tregs+CIA組比較：##P<0.01

圖1 OC-Tregs共培養(yǎng)體系中OC數(shù)量和骨吸收陷窩的變化(×100)注：a.OC+Tregs+Control組；b.OC+Tregs+CIA組；c.OC+Tregs+LEF組；d.OC+Tregs+YSJB組

3.2 益腎蠲痹丸對OC-Tregs共培養(yǎng)內(nèi)IL-10 和HMGB1蛋白表達的影響

與OC+Tregs+Control組比較，OC+Tregs+CIA組、OC+Tregs+LEF組和OC+Tregs+YSJB組Tregs分泌的IL-10含量顯著降低(P<0.01)；與OC+Tregs+CIA組比較，OC+Tregs+LEF組和OC+Tregs+YSJB組Tregs分泌的IL-10含量顯著增加(P<0.01)。

表3顯示，與OC+Tregs+Control組比較，OC+Tregs+CIA組、OC+Tregs+LEF組和OC+Tregs+YSJB組破骨細胞分泌的HMGB1含量顯著增加(P<0.01)；與OC+Tregs+CIA組比較，OC+Tregs+LEF組和OC+Tregs+YSJB組破骨細胞分泌的HMGB1含量顯著減少(P<0.01)。

3.3 益腎蠲痹丸對OC-Tregs共培養(yǎng)內(nèi)IL-10 mRNA和HMGB1、RAGE mRNA表達的影響

與OC+Tregs+Control組比較，OC+Tregs+CIA組Tregs中IL-10 mRNA表達量顯著降低(P<0.01)；與OC+Tregs+CIA組比較，OC+Tregs+LEF組和OC+Tregs+YSJB組Tregs中IL-10 mRNA表達量顯著增加(P<0.01)。

表3顯示，與OC+Tregs+Control組比較，OC+Tregs+CIA組、OC+Tregs+YSJB組中破骨細胞HMGB1 mRNA表達量明顯增加(P<0.01，P<0.05)，OC+Tregs+CIA組中破骨細胞RAGE mRNA表達量明顯升高(P<0.05)；與OC+Tregs+CIA組比較，OC+Tregs+LEF組和OC+Tregs+YSJB組中破骨細胞HMGB1、RAGE mRNA表達量明顯減少(P<0.01，P<0.05)。

表3 OC-Tregs共培養(yǎng)體系內(nèi)IL-10、HMGB1、RAGE 表達的變化

注：與OC+Tregs+Control組比較：**P<0.01，*P<0.05；與OC+Tregs+CIA組比較：##P<0.01，#P<0.05

4 討論

益腎蠲痹丸以熟地黃、淫羊藿、骨碎補補肝腎、扶正氣；以烏梢蛇、白僵蠶、全蝎、露蜂房蠲痹通絡(luò)，搜剔病邪，諸藥相合、標本兼顧、扶正祛邪對痹癥有較好的療效[7-8]。實驗研究也表明，益腎蠲痹丸能減輕CIA大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度，顯著抑制CIA大鼠組織病理改變，且對腎虛證和脾虛證CIA大鼠也有明顯的療效[9-11]。大鼠的病理學(xué)研究表明，益腎蠲痹丸能使滑膜組織炎癥減輕，膠原纖維沉著減少，軟骨細胞增生修復(fù)[12]。

RA是最常見的自身免疫性疾病，可以導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形及功能喪失，抑制RA患者關(guān)節(jié)局部破壞對于治療RA有重要意義。研究表明，骨組織和免疫系統(tǒng)之間相互影響[13]。因此本課題組建立了OC-Tregs共培養(yǎng)體系，以期探討骨與免疫系統(tǒng)之間的關(guān)系，并應(yīng)用此培養(yǎng)體系探討雷公藤甲素對該培養(yǎng)體系中OC分化的影響[4]。YSJB是臨床治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的常用中成藥，研究表明該藥對免疫系統(tǒng)有調(diào)節(jié)作用，因此本研究以該共培養(yǎng)體系為研究對象，探討YSJB治療RA 的作用機制。結(jié)果顯示，OC+Tregs+CIA組OC數(shù)目和骨陷窩吸收面積顯著高于OC+Tregs+Control組，而YSJB能明顯抑制共培養(yǎng)體系中OC 的分化，減少OC的骨吸收。

有研究表明，Tregs調(diào)節(jié)作用部分依賴于IL-10抑制促炎因子生成[14]。HMGB1是RA中重要的促炎介質(zhì)，血清HMGB1水平升高與更具破壞性的關(guān)節(jié)炎有關(guān)[15]；而且RAGE是HMGB1的受體， HMGB1的分泌增加和RAGE的表達增加能促進炎癥的發(fā)展[16]。本實驗結(jié)果表明，共培養(yǎng)體系Tregs IL-10分泌OC+Tregs+CIA組明顯低于OC+Tregs+Control組，OC HMGB1、RAGE分泌和表達OC+Tregs+CIA組明顯高于OC+Tregs+Control組；而OC+Tregs+YSJB組IL-10含量明顯高于OC+Tregs+CIA組，HMGB1、RAGE表達明顯低于OC+Tregs+CIA組，說明YSJB能促進共培養(yǎng)體系中Tregs對IL-10的分泌，抑制OC中HMGB1和RAGE的表達。

綜上所述，益腎蠲痹丸能抑制OC-Tregs共培養(yǎng)體系中OC分化和骨吸收功能，其機制與促進Tregs IL-10的分泌，抑制OC HMGB1、RAGE表達有關(guān)，這可能是其治療RA的作用機制之一。

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