Rac1在血清中的表達與胃癌易感關系研究

（1青海大學附屬醫院 青海 西寧 810001）

（2青海省第五人民醫院 青海 西寧 810001）

（3青海大學研究生院 青海 西寧 810001）

（4青海大學醫學院 青海 西寧 810001）

Rac1作為小GTPases蛋白家族Rac亞家族的成員之一，其成員主要包括Rac1、Rac2、Rac3、Rac1b等，這些成員在組織中呈非特異分布，具有GTP結合活性，當與GTP結合時具有生物學活性，與GDP結合時活性喪失[1]。其活性調節的過程主要由鳥甘酸交換因子（GEF）、GTPases激活蛋白（GAPs）、鳥苷酸抑制因子（GDIs）所介導[2]。Rac1可促進肌動蛋白聚合，參與板狀偽足、絲狀偽足和黏著斑的形成調節細胞的遷移和黏附能力[3]。有研究表明Rac1在乳腺癌、肺癌、胃癌、淋巴細胞白血病等腫瘤中高表達[4]。Carolina E.等向結腸癌細胞sw620中分別轉染過表達野生型Rac1的質粒和不表達Rac1的質粒，結果發現前者結腸癌細胞的表型明顯惡化，而后者結腸癌細胞幾乎停止增殖，提示Rac1與腫瘤的發生、發展有關[5]。Georgina A等使用Rac1抑制劑ZINC69391 處理惡性膠質瘤細胞發現，6h后細胞增殖能力減弱，出現明顯的凋亡，24h后發生遷移的細胞數明顯減少，提示Rac1在腫瘤中主要發揮促增殖、抗凋亡及促進腫瘤遷移的作用[6]。Rac1對腫瘤細胞凋亡的調節主要是通過調節細胞周期及細胞骨架的形成來實現的。Huang YS等應用RNA干擾技術或Rac1抑制劑降低結腸癌、乳腺癌細胞中Rac1表達后，均出現細胞凋亡率增加，G1期細胞數目增多，CyclinD1表達下調的現象[7-8]。Rac1對腫瘤遷移能力的調節與其對細胞骨架的影響密切相關。有研究結果顯示，在肺癌細胞中轉染ITSN-1后肺癌細胞的增殖受到抑制，同時多余的ITSN-1將通過Cbl E3泛素化酶使Eps8發生泛素化，抑制Eps8與mSos形成復合體而損傷Rac1，損傷后的Rac1在ITSN-1的作用下形成較細的肌動蛋白束和較小的黏著斑，進而抑制肺癌細胞的遷移[9]。此外，Rac1還可通過促進腫瘤血管形成促進腫瘤遷移。乳腺癌中活化的Rac1/cdc42降低p53的表達量，促進人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）增殖，促進乳癌遷移。同時，Rac1/cdc42的活化可使p53發生泛素化降低其穩定性，促進血管的生成，進而促進乳癌的轉移[10]。

青海是全國胃癌高發地區，其發病機制和涉及的相關細胞內信號途徑一直未被闡明清晰，本研究通過對比胃癌患者和健康對照組之間Rac1在血清中的表達情況，了解其與胃癌易感關系，為胃癌的最終診療提供重要的實驗依據。

1.資料及方法

1.1 研究對象

收集青海大學附屬醫院、青海省第五人民醫院胃癌患者80例；青海大學附屬醫院體檢中心收集健康體檢者血清80例，作為對照組。全部患者及健康對照組一般資料差異對比，無統計學意（P＞0.05）。

1.2 實驗設備與試劑

設備：iMax全波長酶標儀（伯樂，美國），臺式冷凍離心機（Effendorf，德國），水浴鍋（北京六一，中國），恒溫培養箱（上海萬恒，中國）。

試劑：人Rac 1 Elisa試劑盒（武漢依萊普利，中國）。

1.3 方法

1.3.1 血清分離 將收集的胃癌患者及健康體檢者含抗凝劑的全血于4℃，以3000rpm/min離心8min，抽取上清約500μL于-80℃超低溫冰箱保存備用。

1.3.2 標準品配置 將人Rac1試劑盒于室溫下平衡30min，取出相應凍干標準品，以12000rpm/min在常溫下離心10min，加入對應標準品稀釋液1mL，輕輕搖動，于室溫下放置10min，使標準品完全溶解，配置成已知濃度的標準品；并取8個滅菌1.5mL離心管編號1-8，向1號離心管中加入200μL已知標準品，其余各離心管中均加入100μL標準品稀釋液，采用倍比稀釋法將已知濃度標準品稀釋2、4、8、16、32及64倍。

1.3.3 Elisa酶鏈標記反應檢測 將配好的濃度梯度標準品從低濃度到高濃度依次上樣于酶標板，同時抽取各血清標本100μL上樣于酶標板，置于37℃恒溫培養箱孵育90min。孵育結束后，于濾紙上將酶標孔中液體拍干，將酶結合物濃縮液按1:100比例稀釋，以100μL加于各酶標孔中，混勻，37℃恒溫培養箱中孵育60min。生物素化抗體濃縮液按1:100的比例稀釋，以100μL的量加入各孔中，37℃孵育30min。待標準品顏色梯度出現后，向各孔中加入50μL反應終止液，于全波長酶標儀450nm處檢測各孔吸光度。

1.4 統計學分析

統計分析采用SPSS19.0進行，數據以相對數表示，兩兩比較采用χ2檢驗，檢驗水準ɑ=0.05。

2.結果

2.1 胃癌患者血清Rac1表達水平

通過對胃癌和健康對照組血清Rac1表達情況的檢測，結果顯示，胃癌患者血清Rac1的陽性率為75%，而健康對照組血清Rac1的陽性率為33.75%，胃癌患者血清Rac1的陽性率顯著高于健康體檢者，兩組相比具有統計學意義（P＜0.001）（表1）。

表1 胃癌患者和健康體檢者血清Rac1陽性率

2.2 Rac1表達與患者臨床病理特征關系

通過對患者臨床病理特征資料與Rac1表達進行分析，發現Rac1在血清中的表達水平與患者性別、年齡無關（P＞0.05）。但是，Rac1表達在低分化胃癌和發生淋巴結轉移的胃癌中較高，與高中分化胃癌組織、未發生淋巴結轉移胃癌組織相比具有顯著差異性（P＜0.05）（表2）。

表2 胃癌患者血清Rac1的陽性率與臨床病理特征

3.討論

Rac1是G蛋白家族成員之一，位于7號染色體，具有GTP激酶活性，可與GTP或GDP結合，當其與GTP結合時具有生物學活性，可參與應力纖維、黏著斑的形成，調節細胞骨架重塑、板狀偽足及片狀偽足的形成，維持細胞極性，進而調節細胞的遷移及增殖能力。有研究表明，Rac1在結腸癌、乳腺癌和肺癌等腫瘤中高表達，且其在腫瘤中的表達量變化與腫瘤的遷移能力成正相關[11]。另有研究表明，Rac1可通過活化PAK1等下游分子激活LIMK1,后者與胃癌的分化、淋巴結轉移、遷移、侵襲能力有關。

本研究結果顯示，胃癌患者血清中Rac1的陽性率高于健康體檢者，且低分化胃癌患者血清Rac1的陽性率高于高中分化胃癌患者，發生淋巴結轉移胃癌患者血清Rac1陽性率高于未發生淋巴結轉移者，而與患者的性別及年齡無關。提示血清Rac1的陽性率與胃癌的發生、轉移及分化程度相關。

[1] Vigil D,Cherfils J,Rossman KL,et al.Ras superfamily GEFs and GAPs:validated and tractable targets for cancer therapy[J],Nat Rev Cancer,2010,10:842-857.

[2] Jaffe A. B.,Hall, A.Rho GTPases: biochemistry and biology[J]. Annu. Rev. Cell Dev. Biol,2005,21:247-269.

[3] Parri, M., Chiarugi, P.Rac and Rho GTPases in cancer cell motility control[J]. Cell Commun.Signal.,2010.8:23.

[4] Andrew P.,Alexandra P., Angeliki M.,et al.Deregulation of Rho GTPases in cancer[J].2016,7(3):123-138.

[5] Carolina E.,Mar1′a VC.,Miguel A.,et al.A critical role for Rac1 in tumor progression of human colorectal adenocarcinoma cells[J].AJP,2008, 172(1):156-166.

[6] Georgina A.,Nazareno G.,Matias C.,et al.Proapoptotic and antiinvasive activity of Rac1 small molecule inhibitors on malignant glioma cells[J].OncoTargets and Therapy,2014,7 2021-2033.

[7] Huang YS,Jie N,ZhangXY.et al.shRNA-induced silencing of Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 inhibits the proliferation of colon cancer cells through upregulation of BAD and downregulation of cyclin D1[J],Mol Med.,2018,41(3):1397-1408.

[8] Yoshida T, Zhang Y,Rivera R.,et al.Blockade of Rac1 activity induces G1 cell cycle arrest or apoptosis in breast cancer cells through downregulation of cyclin D1, survivin,and X-linked inhibitor of apoptosis protein[J].Mol Cancer Ther,2010,9(6):1657-1668.

[9] Jeganathan,Predescu D., Zhang Jin,et al.Rac1-mediated cytoskeleton rearrangements induced by Intersectin-1s deficiency promotes lung cancer cell proliferation,migration and metastasis[J].Molecular Cancer,2016,15:59-75.

[10] Ma J,Xue Y,Liu W,et al.Role of activated Rac1/Cdc42 in mediating endothelial cell proliferation and tumor angiogenesis in breast cancer[J].PLoS One,2013;8-10.

[11]章碩.Rac1與腫瘤的研究進展[J]。國際病理科學與臨床雜志，2011，31（5）：410-415.