右美托咪定對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷心肌組織炎癥反應和氧化應激損傷的影響

任國強 陳 萍 于金貴

(山東大學齊魯醫院麻醉科山東省精神衛生中心，山東 濟南 250014)

近年來，急性心肌梗死的發病人數和年齡有著明顯升高和年輕化的趨勢〔1,2〕。目前，心肌血運重建術是臨床上急性心肌梗死治療的主要手段，而缺血再灌注損傷(I/R)是影響治療過程中常見生理病理因素。右美托咪定(Dex)是一種在血管疾病圍術期起到麻醉和鎮痛作用的常用藥物。已有大量文獻證實，Dex對I/R有一定的改善作用，但其具體的作用機制尚不明確〔3～6〕。本研究從炎癥和氧化應激反應出發，探討Dex改善I/R的相關機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料 健康SPF級雄性SD大鼠30只，體質量220～250 g，購于昆明醫科大學實驗動物中心，Dex購于江蘇恒瑞醫藥有限公司。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6試劑盒和二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒購于杭州四季青公司。放射免疫沉淀法(RIPA)蛋白裂解液、逆轉錄試劑盒和總RNA提取試劑盒購于碧云天生物技術研究所，核轉錄因子(NF)-κB p65和血紅素加氧酶(HO)-1蛋白、β肌動蛋白(β-actin)和辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗購于美國Santa Cruz公司。K-H灌流液配方參照鄭凌云等〔7〕研究。Langendorff灌流系統和張力換能器連接多道生理信號采集系統購于成都儀器廠。

1.2方法

1.2.1大鼠實驗分組及離體心臟I/R模型的制備 實驗分組：將30只大鼠隨機分為對照組、I/R組、Dex-M組(2.3 ng/ml)，每組10只。對照組大鼠在心臟離體平穩30 min后，持續灌注150 min，I/R組、Dex-L組、Dex-M組和右美托咪定-H組大鼠均在心臟離體平穩30 min后，停罐30 min，再灌注120 min。離體心臟I/R模型制備：將大鼠以10%水合氯醛進行腹部麻醉后，迅速取出心臟，主動脈插管后，將心臟固定在Langendoff灌流裝置上。常溫下，以含5%CO2和95%O2的K-H溶液進行恒溫恒壓灌流，連通生理信號采集處理系統，心臟穩定30 min后，在心肌張力和心率恢復正常時，停灌30 min，根據實驗分組進行加藥，灌注120 min。記錄并收集心功能心率(HR)、左心室舒張壓(LVDEP)、冠脈流量(CF)、室內壓最大上升速率(+dp/dtmax)和室內壓最大下降速率(-dp/dtmax)等指標。

1.2.2心肌組織中炎癥因子和氧化應激指標的測定 在灌流結束后，收集各組大鼠的心肌組織，于4℃下制成勻漿(濃度10%)，離心取上清液，根據試劑盒操作步驟測定各組大鼠心肌組織中TNF-α、IL-6、MDA含量及SOD活性。每組重復檢測3次。

1.2.3心肌組織中NF-κB p65和HO-1蛋白的測定 灌流結束后，將各組大鼠心肌組織剪碎后，加入蛋白裂解液提取總蛋白，并采用BCA試劑盒檢測其濃度。將蛋白樣品與loading buffer混勻后，置于100℃水浴中變性。將蛋白樣品60 μg滴加到十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠孔中，開始以70 V電壓，后改用90 V電壓電泳分離。待電泳結束后，以250 mA的電流將蛋白樣品轉至聚偏二氟乙烯膜上，再置于含有脫脂奶粉的封閉液中處理2 h。于4℃下加入一抗(NF-κB p65、HO-1和β-actin)反應過夜。次日，以封閉液洗滌后，室溫下加入二抗反應1 h。洗滌后，于避光條件下，加入電化學試劑顯色，以凝膠成像系統采集圖片，圖像軟件分析各目的蛋白的表達水平。每組實驗重復3次。

1.2.4心肌組織中NF-κB p65和HO-1 mRNA的測定 在灌流結束后，收集各組大鼠的心肌組織，剪碎，以總RNA提取試劑盒提取總RNA，并參照逆轉錄試劑盒合成DNA。將20 μl反應體系按照設定的擴增條件上PCR儀，以β-actin作內參，2-△△Ct法測定NF-κB p65和HO-1 mRNA的相對表達水平。擴增條件： 94℃ 預變性5 min，95℃變性15 s，56℃退火15 s，72℃ 延伸30 s，32個循環。β-actin上游引物為5′-GGACCTGACTGACTACC-TC-3′，下游引物為5′-TACTCCTGCTTGCTGAT-3′。其中NF-κB p65上游引物為5′-CGGGATGGCTACTATGAGGCTGAC-3′，下游引物為5′-GATTCGCTGGCTAATGGCTTGC-T-3′；HO-1上游引物為5′-TCCGATGGGTCCTTACACTC-3′，下游引物為5′-AAGGAAGCCAGCCAAGAGA-3′。

2 結 果

2.1Dex對心功能的影響 與對照組相比，I/R組中HR、CF、+dp/dtmax和-dp/dtmax指標均明顯降低，LVDEP指標明顯升高，心功能減弱；在I/R基礎上給予Dex后，HR、CF、+dp/dtmax和-dp/dtmax指標明顯升高，而LVDEP指標明顯降低，心功能有所改善。差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 Dex對心功能的影響

與對照組相比：1)P<0.05；與I/R組相比：2)P<0.05；下表同

2.2Dex對心肌組織中炎癥反應的影響 與對照組相比，I/R組和Dex組大鼠心肌組織中IL-6和TNF-α含量均明顯升高，但Dex組中兩種因子的含量又明顯低于I/R組，差異均有統計學意義(P<0.05)。表明Dex明顯改善大鼠離體心臟I/R損傷引起的炎癥反應。見表2。

表2 Dex對心肌組織中IL-6、TNF-α含量及SOD活性和MDA含量的影響

2.3Dex對心肌組織氧化應激反應的影響 與對照組比較，I/R組和Dex組大鼠心肌組織中SOD活性均明顯降低，而MDA含量均明顯升高；與I/R組相比，Dex組中SOD活性升高，而MDA含量下降。提示Dex明顯改善大鼠離體心臟I/R損傷引起的氧化應激損傷，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

2.4Dex對心肌組織中NF-κB p65和HO-1蛋白的影響 與對照組相比，I/R組和Dex組中NF-κB p65和HO-1蛋白的表達水平均明顯升高；Dex組中NF-κB p65的表達水平下降，而HO-1蛋白的表達升高，與I/R組相比，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1、表3。

圖1 Western印跡法檢測結果

2.5Dex對心肌組織中NF-κB p65和HO-1 mRNA表達的影響 RT-PCR檢測各組大鼠心肌組織中NF-κB p65和HO-1 mRNA的表達。I/R組和Dex組中NF-κB p65和HO-1 mRNA的表達水平均明顯升高，與對照組相比，差異有統計學意義(P<0.05)；與I/R組相比，Dex組中NF-κB p65 mRNA的表達水平下降，而HO-1 mRNA的表達升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠心肌組織中NF-κB p65和HO-1蛋白及mRNA的相對表達量

3 討 論

I/R是影響急性心肌梗死治療的重要因素。HR、LVDEP、CF、+dp/dtmax和-dp/dtmax指標的改變是反映I/R的重要表現。本研究發現，與對照組相比，I/R組和Dex組中HR、CF、-dp/dtmax和-dp/dtmax指標降低，LVDEP指標升高，表明I/R模型構建成功。同時，與I/R組相比，Dex組中HR、CF、+dp/dtmax和-dp/dtmax指標升高，LVDEP指標下降。表明Dex可以改善離體心臟I/R。這一結果與陳雪君等〔8〕得到Dex后處理能夠改善缺血再灌注左心室功能，減輕心肌缺血再灌注損傷的結論相吻合。

心肌I/R是一個復雜的過程，炎癥和氧化應激是其形成和發展的重要機制〔9，10〕。TNF-α是機體受到刺激后，發揮關鍵始動作用、激活細胞因子級聯反應的重要物質，反映了炎癥反應的程度；IL-6是由巨噬細胞、T細胞和單核細胞等產生，反映組織損傷早期情況的物質，兩者均在炎癥反應中起促進作用，是常用的炎癥檢測指標。MDA是脂質過氧化反應過程中產生的一種具有生物毒性的代謝產物，可反映自由基的損傷程度；SOD是一種具有清除自由基功能的抗氧化酶，可反映機體清除氧自由基的能力；兩者是常用的氧化應激指標。張玉輝等〔11〕研究指出，Dex通過抑制促炎因子TNF-α和IL-6的釋放，減輕了心臟瓣膜置換術患者心肌缺血再灌注引起的損傷。Zeng等〔12〕發現，在糖尿病大鼠短暫腦缺血再灌注誘導的氧化應激和炎癥反應中，Dex可通過下調MDA、NOX2、TNF-α和IL-6等減弱氧化應激和炎癥反應。本研究結果發現，在I/R基礎上，給予Dex處理后，心肌組織中IL-6、TNF-α和MDA含量下降，而SOD活性升高。表明Dex能夠減輕離體心臟缺血再灌注損傷中的炎癥反應和氧化應激損傷。

NF-κB是炎癥反應的重要轉錄因子，在調控活性氧、炎性因子和細胞因子等的產生和分泌過程中扮演著重要角色〔13〕。HO-1是一種血紅素降解的限速酶，在阻止炎癥過程和氧化性組織損傷中發揮著重要的保護作用〔14，15〕。Wang等〔16〕指出，Dex可通過抑制NF-κB表達減弱炎癥反應，進而發揮了保護腦缺血/再灌注損傷的作用。王宇恒等〔17〕研究發現，Dex能夠上調細胞中HO-1蛋白的表達，發揮抗氧化應激損傷的作用。本研究發現，與I/R組相比，Dex組中NF-κB p65蛋白和mRNA的表達下降，而HO-1 蛋白和mRNA的表達升高。提示Dex可能通過下調NF-κB p65和HO-1表達，抑制離體心臟缺血再灌注損傷過程中的炎癥和氧化應激過程。

綜上所述，右美托咪定可減輕離體心臟I/R損傷，其作用機制可能與下調NF-κB p65炎癥通路及上調HO-1抗氧化通路，改善心肌組織的炎癥和氧化應激水平有關。這為離體心臟I/R的發生和發展提供了新的線索，也為右美托咪定改善離體心臟I/R損傷提供了新的依據。

4 參考文獻

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