定量熒光PCR篩查Y染色體AZF微缺失

楊 曦，黃偉偉，盧 建

目前全世界大約有15%的夫婦不育，其中男性不育約占50%[1]。引起男性不育的因素有很多，非遺傳因素的有隱睪、精索靜脈曲張、輸精管阻塞、生殖系統感染、內分泌紊亂等[2]。由遺傳缺陷引起的精子發育障礙約占男性不育的30%，遺傳因素的有克氏綜合征性、Y染色體微缺失等，Y染色體微缺失是除了克氏綜合征導致男性特發性不育的第二大遺傳因素[3-4]。Y染色體微缺失是由于Y染色體上的精子生成基因(azoospermia factor,AZF)發生了微缺失，AZF基因與精子生成有關分，其存在互不重疊的3個區域，即AZFa、AZFb和AZFc[1]。本文應用多重定量熒光PCR(quantitative fluorescent PCR,QF-PCR)毛細管電泳法[3,5]，對無精子癥和少精子癥的患者中進行Y 染色體AZF微缺失常規篩查，現報道如下。

1 資料與方法

1.1臨床資料選擇2015年1月至12月于廣東省婦幼保健院就診的精子發生障礙男性不育患者647例，年齡(32.8±6.1) 歲。按照WHO精液分析標準確診為無精癥120例、嚴重少精60例、少精癥467例,使用EDTA·K2真空采血管抽取靜脈血2 mL。WHO精液分析標準：3次檢查精子密度，且精液離心后也未能發現精子為無精; 精子密度<5×106·mL-1為嚴重少精；精子密度<15×106·mL-1為少精。

1.2實驗方法

1.2.1基因組DNA提取使用達安基因公司的Smart 32核酸提取儀，廣州美基生物公司的磁珠提取試劑盒進行外周血DNA提取，嚴格按照試劑盒說明書進行。使用NanoDrop 2000 進行DNA濃度檢測。

1.2.2PCR擴增PCR引物使用歐洲男科協會/歐洲分子遺傳質量協作網(European Academy of Andrology/European Molecular Genetics Quality Network,EAA/EMQN)推薦的序列位置標簽(sequence tagged site,STS)[6]，每個AZF區域使用2個STS序列，AZFa：SY84、SY86，AZFb：SY127、SY134，AZFc：SY254、SY255，以SRY(SY14)和 ZFAX/Y位點為內對照，PCR引物末端FAM、JOE和TAMRA熒光基團標記。擴增體系為PCR Mix 12.5 μL,引物混合物[3]2.5 μL,模板DNA 3 μL，滅菌水7 μL，總體積25 μL。擴增條件：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，54 ℃，30 s，72 ℃，60 s，共28個循環；60 ℃,60 min。設置2個對照：空白水對照、正常男性對照。

1.2.3PCR產物毛細管電泳檢測在96孔板中加入上樣體系，包括去離子甲酰胺9 μL，LIZ-500分子內標 0.5 μL，標記 PCR產物 1 μL, 總體積 10.5 μL。 在95 ℃下加熱變性4 min，然后立即冰上放置 3 min，短暫離心后將96孔板放入ABI 3 500×L測序儀進行毛細管電泳檢測，用GeneMaker(version2.2.0)軟件對毛細管電泳結果進行數據分析。

2 結果

Y染色體AZF微缺失檢測的649例患者中，檢測出Y染色體AZF缺失17 例，缺失率為2.63% (17/647) ，如表1所示。其中AZFa缺失僅1例，AZFc缺失14例，AZFb、AZFc雙重缺失2例。圖1為正常男性的毛細管電泳結果，從圖中可以看出SRY、ZFAX/Y內對照出現了峰，AZF基因3個區域對應6個STS對都出現了峰，說明AZF基因沒有出現微缺失。圖2為AZFc缺失患者毛細管電泳結果，從圖中可以看出AZFc區域對應的2個STS沒有峰出現，說明AZFc區域出現微缺失。

表1 Y染色體AZF缺失病例總數

圖1 GeneMaker軟件分析正常男性AZF微缺失檢測結果

圖2 GeneMaker軟件分析AZFc微缺失患者檢測結果

3 討論

Y染色體AZF區域有編碼精子生成基因，其缺失導致男性生精功能異常，與男性不育密切相關，男性因素所致不孕患者中AZF微缺失率1.3%～14%[7]。AZF通常分AZFa、AZFb、AZFc 3個不同亞區。

AZFa的缺失較少見，約占Y染色體微缺失的1%～5%，本文僅檢測出1例AZFa缺失，AZFa缺失的患者最為嚴重，通常表現為唯支持細胞綜合征(sertoli cell only syndrome,SCOS)，臨床表現為無精子癥[8]。AZFb基因缺失的患者表現為生精阻滯，主要停留在精母細胞或精子細胞階段，睪丸內可見精原細胞和初級精母細胞，但無精子生成；如果同時伴有AZFa或AZFc的缺失，則表現為SCOS或生精阻滯[9]。Y染色體微缺失較為常見AZFc缺失[10]，本研究中共檢測出16例AZcF缺失，14例AZFc單獨缺失，2例為AZFb、AZFc雙重缺失。AZFc缺失的患者其精子數目有進行性下降的趨勢，臨床表現多種多樣，可無精子癥或嚴重少精子癥患者，也可表現為精子計數正常但伴有精子形態異常[2,8]。AZFa、AZFb完全缺失臨床表現較為嚴重，由于患者行睪丸穿刺也不能獲得精子，因此對于該類患者也沒有必要做單精子細胞質內注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)，只能通過他人供精的方式生育后代。一般單獨AZFc缺失患者尚有精子生成能力，可以做ICSI，但是會將AZFc缺失遺傳給男性后代，女性后代不孕的風險通常不會增加，患者可以進行胚胎移植前基因診斷(preimplantation genetic diagnosis,PGD)，選擇女胚進行移植[10-11]。

EAA/EMQN發布的Y染色體微缺失的檢測指南，推薦檢測分別位于AZFa、AZFb 和 AZFc 3個區域的sY84、sY86、sY127、sY134、sY254和sY255 6個STS位點，即每個區域2個STS 位點。以SRY(SY14)和ZFX/Y位點為內對照，SRY是Y染色體特有基因，ZFX/Y在X/Y染色體上都存在。本文中的PCR擴增引物序列為這8個STS位點[3,5]。

目前臨床上用于Y 染色體微缺失的檢測方法很多，有實時熒光PCR、基因芯片、多重 PCR電泳、QF-PCR等。實時熒光PCR操作簡單可以實現邊擴增邊檢測，靈敏度高，有一定的假陽性；另外熒光PCR儀一般只有4～5種熒光信號通道，一次只能檢測4～5個指標，所以對于8個STS位點需要分2個PCR管擴增檢測[1]。基因芯片法PCR擴增完成后需要對PCR產物進行雜交，操作較電泳法麻煩、費時間。國內多數實驗室主要使用多重PCR電泳進行檢測，僅需普通PCR儀和瓊脂糖電泳設備即可，但由于瓊脂糖電泳不能區分相近的大小DNA片段，另外顯色靈敏度也底，需要將引物分多組分別進行PCR擴增、電泳才能進行Y染色體微缺失檢測[9]。而QF-PCR法需要對擴增引物進行熒光標記，由于熒光信號靈敏度較高，毛細管電泳DNA片段大小分度辨高，一管多重PCR擴增可以實現多個STS位點檢測，操作簡便，結果容易判讀，但需要測序儀，可能限制其在臨床的推廣[3]。

Y染色體微缺失的檢測，可以為部分原因不明的無精癥或少精癥患者從分子水平上明確病因，為臨床醫師的診療提供臨床依據；避免患者不恰當的治療，減少患者經濟負擔，為臨床輔助生殖和遺傳咨詢提供指導。

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